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May 14, 2023

Remodelage structurel du carbone

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 1001 (2023) Citer cet article

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Chez Escherichia coli, l'opéron phn à 14 cistrons codant pour la lyase carbone-phosphore permet l'utilisation du phosphore à partir d'une large gamme de composés phosphonates stables contenant une liaison CP. Dans le cadre d'une voie complexe en plusieurs étapes, il a été démontré que la sous-unité PhnJ clivait la liaison CP via un mécanisme radicalaire, cependant, les détails de la réaction n'ont pas pu être immédiatement réconciliés avec la structure cristalline d'un noyau de lyase PhnGHIJ CP de 220 kDa complexe, laissant une lacune importante dans notre compréhension de la dégradation des phosphonates chez les bactéries. Ici, nous montrons à l'aide de la microscopie électronique cryogénique à une seule particule que PhnJ assure la liaison d'un double dimère des protéines de la cassette de liaison à l'ATP, PhnK et PhnL, au complexe central. L'hydrolyse de l'ATP induit un remodelage structurel drastique conduisant à l'ouverture du complexe central et à la reconfiguration d'un site actif putatif et liant les métaux situé à l'interface entre les sous-unités PhnI et PhnJ.

Les bactéries ont développé des mécanismes élaborés pour extraire les macronutriments essentiels, tels que le phosphore, le soufre, l'azote et le carbone, de leur environnement. Chez l'Escherichia coli à Gram négatif, la limitation en phosphate induit le régulon Pho et l'expression de l'opéron phn à 14 cistons (phnCDEFGHIJKLMNOP), permettant l'absorption et la dégradation des phosphonates comme source alternative de phosphore1,2,3. Les phosphonates sont structurellement similaires aux esters de phosphate et à d'autres métabolites primaires, mais contiennent une liaison carbone-phosphore (C-P) très stable, qui résiste au clivage hydrolytique4. Les phosphonates peuvent donc fonctionner comme inhibiteurs et analogues d'état de transition et sont très utiles dans l'industrie comme détergents, herbicides (par exemple, glyphosate/RoundUp®) et antibiotiques5. L'opéron phn code pour un importateur de cassette de liaison à l'ATP (ABC) (PhnCE) et une protéine de liaison périplasmique (PhnD) pour l'absorption des phosphonates6, un régulateur transcriptionnel (PhnF)7, en plus de la machinerie enzymatique complète (PhnGHIJKLMNOP) nécessaire à la dégradation et à l'incorporation dans le métabolisme général via le 5-phospho-α-D-ribosyl-1-diphosphate (PRPP)8,9,10,11. La voie C – P lyase a un spectre de substrat remarquablement large et est capable de gérer des phosphonates aliphatiques ainsi que des phosphonates aromatiques volumineux10,12,13. Pour cette raison, et en raison des nombreuses applications des phosphonates, il existe un intérêt fondamental à comprendre le mécanisme de dégradation des phosphonates par la C – P lyase. Des études fonctionnelles et mécanistes détaillées de sous-unités enzymatiques individuelles codées par l'opéron phn ont conduit à un mécanisme de réaction proposé dans lequel la fraction phosphonate est initialement couplée à l'ATP ou au GTP par déplacement de la nucléobase dans une réaction catalysée par PhnI et en présence de PhnG, PhnH et PhnL8. Il a été démontré que PhnM libère du pyrophosphate du 5'-phosphoribosyl-α-1-phosphonate résultant pour permettre à PhnJ de cliver la liaison C – P via un mécanisme de réaction radicalaire glycine strictement anaérobie S-adénosyl méthionine (SAM). Enfin, l'action combinée de PhnP et PhnN convertit le ribose cyclique résultant en PRPP (Fig. 1 supplémentaire)9,10.

Cependant, en raison de la complexité de la réaction, du grand nombre de sous-unités et de complexes protéiques impliqués et de l'exigence anaérobie, il n'a pas encore été possible d'obtenir une compréhension mécaniste complète de la voie C – P lyase. La structure cristalline d'un complexe enzymatique central, Phn(GHIJ)2, a révélé un hétéro-octamère symétrique constitué d'un tétramère compact et central des sous-unités PhnI et PhnG interagissant chacune individuellement avec les sous-unités plus distales PhnJ et PhnH14. Une caractéristique intrigante de cette structure est que le site du cluster Fe4S4, vraisemblablement requis pour la formation de radicaux et l'activation enzymatique, est situé à une distance significative (30 Å) d'un résidu glycine dans PhnJ, ce qui a été montré par des études d'échange de deutérium comme étant la localisation stable d'un radical entre les cycles de renouvellement enzymatique15. La structure cristalline a également révélé un autre site actif putatif à l'interface de PhnI et PhnJ contenant un ion Zn2+ coordonné par deux résidus His conservés dans PhnI, tous deux avérés essentiels à la croissance sur phosphonate. Enfin, il a été constaté que parmi les deux modules ABC non transporteurs codés par l'opéron phn, PhnK et PhnL, une seule sous-unité de PhnK peut se lier à PhnJ via une région hélicoïdale conservée connue sous le nom de domaine d'insertion central (CID)14. Chez les bactéries, les modules ABC sont principalement associés à des importateurs de métabolites où ils interagissent en tant que dimères avec un domaine transmembranaire pour se lier et hydrolyser l'ATP, générant ainsi l'énergie et le mouvement nécessaires au transport contre un gradient de concentration16. La structure dimère générale des modules ABC n'offrait donc pas grand-chose pour comprendre la fonction de la seule sous-unité PhnK liée au complexe central de la lyase C – P. De plus, cette divergence suggérait que la structure observée pourrait ne pas représenter un véritable état fonctionnel de l'enzyme et ne fournissait pas de justification de la présence de l'autre module ABC essentiel, PhnL. Dans ce travail, nous montrons génétiquement et enzymatiquement que l'activité ATPase de PhnK et PhnL est nécessaire à la croissance d'E. coli sur les phosphonates et utilisons la microscopie électronique cryogénique (cryo-EM) pour révéler un double dimère des deux sous-unités sur C – P complexe central de lyase. L'analyse structurale dans des conditions de renouvellement de l'ATP révèle en outre que l'hydrolyse conduit à l'ouverture du complexe central exposant et réarrangeant le site actif Zn2+ situé entre les sous-unités PhnI et PhnJ.

Pour mieux comprendre l'interaction des sous-unités ABC avec la C – P lyase et le rôle de ces modules dans la catalyse, nous avons initialement purifié le complexe de base lié à PhnK à partir d'un plasmide codant PhnGHIJK avec PhnK étiqueté His comme décrit précédemment14 et déterminé une haute résolution structure du complexe C – P lyase purifié par cryo-EM (Fig. 2a supplémentaire et Fig. 3 supplémentaire). Une carte initiale générée à l'aide de 901 800 particules a donné une structure avec une résolution globale de 2,2 Å (en utilisant le critère de coupure de la corrélation de coquille de Fourier (FSC) 0,14317) du complexe central de lyase C – P lié à une seule sous-unité PhnK comme observé précédemment (Fig. 1a)14,16. PhnK affichait une résolution nettement inférieure à celle du complexe central PhnGHIJ. Nous avons donc utilisé la classification 3D avec soustraction de signal pour concentrer le raffinement sur PhnK et avons obtenu une classe finale composée de 50 323 particules à une résolution de 2, 6 Å. Cette carte avait une densité améliorée pour PhnK et permettait de tracer le pli complet de la protéine (Fig. 1a, Fig. 3 supplémentaire et Tableau supplémentaire 1). L'analyse de variabilité a révélé plusieurs positions distinctes de PhnK représentant un mouvement en forme de charnière du domaine ABC autour du site d'interaction (Fig. 1b) 18,19. L'interaction spécifique de PhnK avec le CID de PhnJ est principalement due à des interactions électrostatiques impliquant des résidus chargés négativement sur PhnJ (Glu149, Asp226, Asp228 et Asp229) et un patch positif sur PhnK (Arg78, Arg82 et Arg116) (Fig. 1c , d). Ces interactions sont encore stabilisées par une interaction hydrophobe entre PhnJ Tyr158 et PhnK Tyr118. PhnK adopte un domaine classique de liaison aux nucléotides (NBD) similaire aux domaines cytoplasmiques des transporteurs ABC et contient tous les motifs catalytiques conservés (Walker A/B, boucle Q, signature ABC et commutateur H, Fig. 1d, e), plusieurs qui sont directement impliqués dans la liaison et l'hydrolyse de l'ATP20. Dans un sous-ensemble de classes 3D, une densité EM supplémentaire était visible près de la boucle P de PhnK (Fig. 1e et Fig. 2b supplémentaire). La densité chevauche partiellement celle de l'ATP à l'intérieur des modules NBD dans les transporteurs ABC (Fig. 1f), mais le manque de caractéristiques à haute résolution suggère que toute liaison de nucléotide est désordonnée et par conséquent que PhnK n'est pas dans un état catalytiquement compétent. Ceci est cohérent avec la compréhension générale selon laquelle les modules ABC ne sont actifs que dans leur état dimère. En résumé, nous concluons que lorsqu'une seule sous-unité PhnK se lie au complexe central de la lyase C – P, elle est structurellement désordonnée et ne peut pas s'engager dans l'hydrolyse de l'ATP. De plus, et contrairement aux observations précédentes16, nous n'observons aucun changement structurel significatif dans le complexe central PhnGHIJ, y compris le site putatif du cluster Fe4S4, lors de la liaison d'une seule sous-unité PhnK (rmsd = 0, 5 Å, Fig. 2c supplémentaire).

a Vue d'ensemble de la structure du complexe central de la lyase C – P (PhnGHIJ, bleu / vert) lié à une seule sous-unité de PhnK (rouge) avec les noms des sous-unités individuelles indiquées. La poche de liaison à l'ATP de PhnK est représentée par une ellipse bleue. b Représentation en surface de la densité EM montrant l'étendue du mouvement d'inclinaison observé dans PhnK. Les deux états extrêmes sont représentés respectivement en gris et en rouge. c Gros plan de l'interaction entre PhnK (rouge) et le domaine d'insertion central PhnJ (CID, bleu) avec les résidus pertinents représentés par des bâtons marqués et des interactions avec des lignes pointillées. d Aperçu de la structure de domaine de PhnK (en haut, rouge) et PhnJ (en bas, bleu) avec les numéros de résidus indiqués. Pour PhnK, l'emplacement des motifs ABC centraux (Walker A et B, boucle Q, motif de signature et commutateur H) est indiqué en orange et le domaine C-terminal en rouge foncé. Pour PhnJ, les caractéristiques qui distinguent la protéine de PhnH avec laquelle elle est homologue (le domaine d'insertion central, CID, résidus 129-169, et le domaine C-terminal, CTD, résidus 235-281) sont représentés en bleu plus foncé. Les quatre résidus Cys près de l'extrémité C-terminale impliqués dans la liaison du cluster Fe4S4 sont indiqués par C. Les interactions entre les protéines sont représentées par des lignes pointillées. e Vue rapprochée de PhnK avec des résidus catalytiquement importants (Tyr15, boucle A ; Gln90, boucle Q ; Asp170/Glu171, motif Walker A ; His204, boucle H) représentés sous forme de bâtons. Une densité supplémentaire observée dans plusieurs classes 3D au niveau du site de liaison des nucléotides est indiquée en bleu. f Structure du domaine ABC du transporteur multidrogue Sav1866 de S. aureus (2ONJ)24 dans la même orientation avec le nucléotide (AMPPNP) et les résidus catalytiquement importants (Tyr349, boucle A ; Gln422, boucle Q ; Glu503, motif Walker A ; His534, H boucle) sous forme de bâtonnets et l'ion Mg2+ sous forme de sphère violette.

Pour capturer PhnK dans une conformation stable liée aux nucléotides, nous avons introduit la mutation E171Q dans le motif Walker B (Fig. 1e), qui est connue pour permettre la liaison, mais pas l'hydrolyse de l'ATP dans les modules ABC21. Nous avons ensuite purifié le complexe CP lyase tel qu'exprimé à partir d'un plasmide codant pour la machinerie enzymatique complète (PhnGHIJKLMNOP) à l'aide d'un double Strep-tag C-terminal sur PhnK et en présence de l'analogue ATP non hydrolysable, la β,γ-imidoadénosine 5′ -triphosphate (AMPPNP). La détermination de la structure par analyse de particules uniques cryo-EM à une résolution de 2, 1 Å (59 737 particules, symétrie C2, Fig. 4 supplémentaire et tableau supplémentaire 1) a révélé le complexe central lié à un dimère de PhnK dans une conformation rappelant l'état lié à l'ATP des transporteurs ABC (Fig. 2a, b, sous-unités rouges). À l'interface des deux sous-unités PhnK, une densité claire pour l'AMPPNP a permis la modélisation d'un nucléotide dans les deux poches de site actif (Fig. 2c et Fig. 5a supplémentaire). À l'intérieur de PhnK, le nucléotide adénosine se lie de manière très similaire à ce qui a été observé pour les modules ABC associés à la membrane (Fig. 5d supplémentaire). Aucune différence structurelle n'est observée entre le complexe central de la lyase C – P lorsqu'il est associé à l'état dimérique lié à l'ATP de PhnK par rapport à lorsqu'une seule sous-unité PhnK est liée (rmsd = 0, 3 Å, Fig. 5e supplémentaire). Remarquablement, cette structure a également révélé deux copies d'une protéine supplémentaire située au-dessus des sous-unités PhnK, que nous avons pu identifier comme PhnL par spectrométrie de masse et inspection de la densité EM (Fig. 2a, b, sous-unités jaunes et Fig. 6a supplémentaire). ). PhnL a un pli NBD comme PhnK mais diffère par l'absence d'un domaine C-terminal conservé également trouvé dans les modules ABC des transporteurs et par la présence d'une longue épingle à cheveux β près de l'extrémité N qui résulte de l'extension de β1 et β2 (Fig. 2a, b, extension β, vert). L'association d'une sous-unité PhnL avec chacune des deux sous-unités PhnK génère ainsi un double dimère de sous-unités ABC, toutes deux dans la même orientation l'une par rapport à l'autre et au complexe de cœur et donc potentiellement capables de se lier aux nucléotides. Dans ce complexe hétéro-dodécamère de 327 kDa, PhnL est dans un état ouvert de type ADP sans densité visible pour un nucléotide. L'interaction entre PhnK et PhnL est médiée par un large éventail d'interactions spécifiques, principalement via le domaine C terminal étendu de PhnK, qui contient deux hélices α (α8 et α9) qui facilitent la plupart des contacts avec PhnL, y compris son épingle à cheveux β étendue (Fig. .2d–f). Les interactions sont principalement ioniques, la région de liaison (face supérieure) de PhnK ayant une charge globale négative (résidus 231 à 247) et PhnL (face inférieure) étant chargée positivement (Fig. 6b supplémentaire). De plus, il existe un empilement π – π entre PhnK Trp29 et PhnL Arg82 (Fig. 2d). L'Arg dans PhnL est entièrement conservé dans les orthologues, tandis que le Trp dans PhnK est fonctionnellement conservé pour sa capacité d'empilement (Fig. 6c supplémentaire). En résumé, nous concluons que les deux sous-unités ABC non transporteuses codées par l'opéron phn, PhnK et PhnL, peuvent se lier simultanément au complexe central de la lyase C – P dans une conformation double dimère avec PhnK à l'état lié à l'ATP et PhnL dans un état ouvert compatible avec la liaison ATP lors de la fermeture. A notre connaissance, ce type d'interaction entre deux dimères ABC n'a pas été observé auparavant et représente donc un mode fonctionnel jusqu'ici non reconnu des domaines de liaison aux nucléotides ABC.

a En haut, un aperçu de la structure du domaine et des caractéristiques des séquences de PhnL (en haut, jaune) et PhnK (en bas, rouge) avec les numéros de résidus indiqués. Les motifs centraux de l'ATPase (Walker A et B, boucle Q, motif de signature et commutateur H) sont indiqués en orange, l'extension en épingle à cheveux β de PhnL (résidus 7 à 14) est représentée en vert et le domaine C-terminal de PhnK est représenté en rouge foncé. Les interactions entre les protéines sont représentées par des lignes pointillées. b Un aperçu de la structure de PhnGHIJKL avec le complexe de noyau CP lyase PhnGHIJ dans les tons de bleu/vert et les couleurs claires correspondantes pour l'autre moitié, le dimère PhnK en rouge/rouge clair et le dimère PhnL en jaune/jaune clair. Les cases indiquent l'emplacement approximatif des vues rapprochées (c–f). c Détails du site de liaison PhnK ATP avec l'AMPPNP (blanc/orange) illustré à côté des chaînes latérales pertinentes et interactives (bâtonnets étiquetés) et l'ion Mg2+ sous forme de sphère bleue. d Interaction d'empilement observée entre PhnK Trp29 et PhnL Arg82. e Interaction entre l'extrémité C-terminale PhnK (hélices α8 et α9, résidus 236–247) et l'extension en épingle à cheveux PhnL β (résidus 7–14). f Interactions chargées observées entre la région C-terminale PhnK (résidus 210–236) et PhnL.

Pour sonder l'importance des interactions spécifiques entre PhnK et le complexe central ainsi que l'intégrité fonctionnelle de PhnK et PhnL pour la dégradation des phosphonates, nous avons utilisé la complémentation génétique pour tester si l'altération de résidus spécifiques affecterait la capacité d'E. coli à se développer sur phosphonate comme seule source de phosphore (Fig. 3a). La souche E. coli HO1488 (ΔphnHIJKLMNOP), qui n'a pas la capacité de se développer sur du phosphonate, peut être sauvée par l'introduction d'une copie plasmidique de l'opéron phn (pSKA03, voir Méthodes pour plus de détails) et ainsi être utilisée pour tester les effets fonctionnels de mutants des protéines individuelles. Dans un premier temps, nous avons pu montrer que l'incapacité de la souche HO1488 à se développer sur un milieu minimal contenant soit du méthylphosphonate, soit du 2-aminoéthylphosphonate pourrait être génétiquement complétée par l'introduction de pSKA03 (Fig. 3a). Perturbation des résidus clés situés à l'interface d'interaction PhnK-PhnJ (PhnJ E149A, Y158A ou PhnK R78A/R82A) ou inhibition de l'activité ATPase de PhnK ou PhnL par mutation du glutamate catalytiquement actif (PhnK E171Q ou PhnL E175Q)21 à nouveau abolie croissance sur le phosphonate comme seule source de phosphore. Ensemble, cela démontre que l'interaction de PhnK et PhnL avec le complexe central ainsi que l'activité ATPase de ces sous-unités sont nécessaires pour la dégradation des phosphonates in vivo.

un test fonctionnel in vivo utilisant la souche E. coli HO1488 (ΔphnHIJKLMNOP) cultivée soit sans plasmide (-) soit complémentée avec pSKA03 contenant l'opéron phn entier incluant la boîte pho et incluant les mutations spécifiques suivantes : wt (none), PhnJ Y158A, PhnJ E149A, PhnK R78A/R82A, PhnK E171Q et PhnL E175Q. Les cellules ont été étalées sur des plaques de gélose minimale MOPS44 contenant soit du K2HPO4, du 2-AmEtPn, du MePn ou aucune source de phosphore ajoutée (pas de P) comme indiqué. Les planches sont représentatives de deux répétitions. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source. b Activité ATPase utilisant Phn(GHIJKL)2 de type sauvage purifié, Phn(GHIJKL)2-PhnK E171Q (PhnK E171Q) et Phn(GHIJKL)2-PhnL E175Q (PhnL E175Q) mesurée par séparation des espèces de nucléotides par chromatographie échangeuse d'ions après une nuit incubation avec l'ATP. c Activité ATPase de dosage couplé (μmol/min/mg) en utilisant Phn(GHIJKL)2 de type sauvage (wt), Phn(GHIJKL)2-PhnK E171Q (PhnK E171Q), Phn(GHIJKL)2-PhnL E175Q (PhnL E175Q) et le double mutant Phn(GHIJKL)2-PhnK E171Q-PhnL E175Q (E171Q/E175Q). Les barres indiquent la moyenne de trois réactions indépendantes et les barres d'erreur indiquent l'écart type par rapport à la moyenne. Une mesure avec une valeur négative a été exclue de E171Q/E175Q. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Étant donné que l'hydrolyse de l'ATP est essentielle à la capacité d'E. coli à se développer sur le phosphonate, nous avons ensuite demandé si le complexe central de la lyase C – P lié à PhnK et PhnL, Phn (GHIJKL) 2, est actif dans l'hydrolyse de l'ATP in vitro. Pour répondre à cela, le type sauvage purifié, ainsi que les complexes inactivés PhnK et PhnL (Fig. 7a, b supplémentaires), ont été analysés individuellement pour l'activité ATPase par incubation avec ATP et Mg2 + suivie d'une séparation chromatographique des nucléotides (Fig. 3b). comme par un dosage enzymatique couplé d'ATPase (Fig. 3c). Les deux techniques ont révélé une activité ATPase claire pour le complexe PhnGHIJKL de type sauvage, tandis que le complexe Phn (GHIJ) 2K a montré une activité négligeable (Fig. 7c supplémentaire), ce qui correspond à l'exigence de la présence d'un dimère ABC complet pour l'activité ATPase. Pour les deux mutants PhnK E171Q et PhnL E171Q, nous avons observé une activité ATPase significativement réduite, qui était légèrement plus prononcée lorsque PhnK était inactif, tandis que pour le double mutant PhnK E171Q / PhnL E171Q, l'activité était complètement absente (Fig. 3c). En résumé, nos données fonctionnelles montrent clairement que l'activité ATPase de la C – P lyase nécessite un dimère de sous-unités ABC et que PhnK et PhnL sont nécessaires pour une activité maximale in vivo et in vitro. De plus, les deux sous-unités doivent être capables de se lier au complexe central de la lyase C – P pour que la dégradation des phosphonates ait lieu in vivo.

Pour capturer les états conformationnels potentiels supplémentaires du complexe résultant de l'activité ATPase dans PhnK et PhnL, nous avons ensuite purifié le complexe Phn(GHIJKL)2 de type sauvage en présence d'ATP et d'EDTA (pour empêcher initialement l'hydrolyse de l'ATP par PhnK), puis ajouté excès de Mg2+ pour initier la réaction immédiatement avant le dépôt sur les grilles cryo-EM et la congélation en plongée. La collecte et le traitement des données Cryo-EM dans ces conditions ont donné des structures de plusieurs états fonctionnels, y compris une structure à haute résolution du complexe Phn (GHIJKL) 2 s'étendant jusqu'à 1, 9 Å en utilisant un ensemble final de 222 056 particules et en imposant une symétrie C2 (Figs. 8 et 9 et tableau supplémentaire 1). Cet état est essentiellement identique à la structure déterminée en présence d'AMPPNP, cependant, une inspection minutieuse du site actif PhnK dans la carte EM haute résolution a révélé qu'il contient de l'ADP et du Pi et représente par conséquent un véritable état post-hydrolyse de l'ATP (Supplementary figure 5b). Nous observons également la liaison de l'ATP aux deux sites de liaison des nucléotides dans PhnL, mais malgré cela, le dimère est toujours dans un état ouvert de type ADP (Fig. 10a supplémentaire).

La classification 3D des données collectées dans des conditions de renouvellement de l'ATP a donné des structures de deux états supplémentaires du complexe central lié à PhnK et, dans certains cas, PhnL (Fig. 4a, b et Fig. 8 et 9 supplémentaires, et Tableau supplémentaire 1). Dans les deux structures, la densité de PhnK est significativement plus faible que dans l'état stable lié à PhnL, ce qui suggère qu'il est plus flexible et peut-être donc que PhnL agit pour stabiliser la conformation fermée de PhnK (Fig. 10b, c supplémentaires). Dans l'une de ces conformations (fermée, 2,0 Å, 81 605 particules, symétrie C2), le dimère PhnK est à l'état fermé lié à l'ATP et ressemble à celui trouvé dans les structures Phn(GHIJKL)2 alors que la densité de PhnL est absente. L'inspection du site actif révèle une densité claire pour l'ATP et le Mg2+, ce qui suggère qu'il s'agit d'un état lié à l'ATP pré-hydrolytique (Fig. 4a et Fig. 5c et 10d, e supplémentaires). Dans l'autre structure (ouverte, 2,6 Å, 31 280 particules, symétrie C1), l'une des deux sous-unités PhnK s'est éloignée de la position fermée de 25 Å tandis que l'autre est restée en place (Fig. 4b).

Vue d'ensemble des changements structurels ayant lieu dans le complexe Phn(GHIJK)2 entre les états fermé (a) et ouvert (b). Le complexe Phn (GHIJK) 2 est représenté sous forme de représentation de surface avec le complexe central de lyase C – P dans les tons de bleu / vert et PhnK en rouge / rouge clair. La flèche indique l'étendue de l'ouverture au niveau du site Zn2+. c Détails du site actif présumé à l'interface entre PhnI et PhnJ dans les états fermé (haut) et ouvert (bas). L'ion Zn2+ est représenté par une sphère grise avec une géométrie de coordination indiquée et des résidus pertinents, interagissant avec des bâtonnets marqués. d Détails de la poche du site actif avec une molécule liée de 5-phospho-α-D-ribose-1,2-phosphate cyclique (PRcP) tel que modélisé dans les états fermé (en haut) et ouvert (en bas). e Mouvement coordonné de l'extrémité PhnI N et de l'extrémité PhnG C de la surface du complexe PhnGHIJK à l'état fermé (en haut) vers le site actif à l'état ouvert (en bas).

En raison de l'attachement de PhnK au complexe central, ce mouvement entraîne également l'éloignement d'un ensemble de sous-unités PhnJ et PhnH du reste du noyau et, dans ce processus, l'exposition du site actif de liaison Zn2 ​​+ et putatif situé au PhnI-PhnJ interface (Fig. 4b). Les deux sous-unités PhnK semblent flexibles (semblables à la structure avec une seule sous-unité PhnK liée) et affichent une résolution locale nettement inférieure à celle du reste du complexe. En raison de cette flexibilité, PhnL n'a pas pu être modélisé à l'état ouvert, mais l'inspection des classes 2D confirme qu'il est présent et éventuellement dans une conformation fermée de type ATP (Fig. 10d, e supplémentaire). Cela suggère que l'ouverture du dimère PhnK pourrait être le déclencheur qui active l'hydrolyse PhnL ATP. En raison de la flexibilité, il n'est pas clair si PhnL est également présent à l'état fermé (post hydrolyse de l'ATP).

Étant donné que le complexe central est apparu monolithique dans toutes les structures précédentes, le mouvement concomitant de PhnK, PhnJ et PhnH à l'état ouvert représente un réarrangement architectural dans la C – P lyase avec des implications fonctionnelles importantes. À l'état fermé, les deux sous-unités PhnI et une sous-unité PhnJ interagissent étroitement pour former un site de liaison Zn2+ situé à l'interface des trois protéines (le site His)14. En plus de deux résidus histidine provenant de PhnI (His328, His333), l'ion Zn2+ est coordonné par trois molécules d'eau et un oxygène d'un ligand inconnu, qui a également été observé précédemment par cristallographie aux rayons X, dans un arrangement octaédrique (Fig. 4c, fermé, et Supplémentaire Fig. 11a)14. Sur la base de l'inspection de la densité EM, nous avons pu modéliser le ligand en tant que 5-phospho-α-D-ribose-1,2-phosphate cyclique (PRcP, figures supplémentaires 1 et 11b) 8,10. Bien qu'il s'agisse d'un intermédiaire de la voie C – P lyase, l'expression de la protéine a été réalisée en l'absence de phosphonates et nous pensons donc qu'elle aurait pu être formée dans une réaction secondaire lors de la surexpression en l'absence de phosphonate et a été transportée pendant purification. En raison des quantités infimes du composé présent (deux molécules par complexe de 350 kDa), les tentatives d'identification par analyse différentielle UPLC-QTOF-MS n'ont pas abouti. Le ligand est étroitement lié à ce site avec des interactions spécifiques entre le fragment ribose et PhnJ Arg107 et Gln124, des contacts entre le 5′ phosphate et une boucle (résidus 47–50) dans PhnJ et enfin entre deux atomes d'oxygène du 1,2- phosphate cyclique, PhnJ His108 et Zn2+ (Fig. 11b supplémentaire). Nous notons également qu'il existe une grande cavité à côté de ce qui correspondrait à la position de l'atome de phosphonate d'un substrat naturel dans cette orientation, ce qui confirme que le composé lié imite un intermédiaire de réaction et pourrait expliquer la large spécificité de substrat de C – P lyase (Fig. 11c supplémentaire).

Au contraire, aucune densité de ligand n'est observée dans le site Zn2+ à l'état ouvert, qui a subi un réarrangement, la boucle de PhnJ qui interagit avec le phosphate 5' du ligand à l'état fermé a été complètement remodelée (Fig. 4d), permettant à His219 d'une chaîne PhnI voisine et au groupe NH2 N-terminal de PhnI de compléter la sphère de coordination Zn2+, qui est maintenant tétraédrique (Fig. 4c, ouverte et Supplémentaire Fig. 11d). Pendant ce temps, His108 de PhnJ, qui interagit avec le groupe phosphate 1,2-cyclique de PRcP à l'état fermé, s'est éloigné d'environ 11 Å de l'ion métallique. Il y a très peu de réarrangements internes dans PhnJ et PhnH, qui semblent se déplacer aussi près des corps rigides (rmsd = 0,6 Å entre les structures à l'état ouvert et fermé de ces sous-unités) à l'exception de la boucle PhnJ 37–49 qui tapisse la poche du site actif et semble aider à accommoder les réarrangements autour de l'ion Zn2+. Cela signifie également qu'il n'y a pas de changement dans la relation structurelle et la distance entre le site putatif du cluster Fe4S4 impliquant les résidus de cystéine PhnJ 241, 244, 266 et 272 et le site radical proposé à PhnJ Gly32. À l'état ouvert du complexe central, Gly32 est enterré à l'intérieur de PhnJ à environ 10 Å de la surface près de la cavité du site actif et à 31 Å de l'ion Zn2+ (Fig. 11e supplémentaire).

L'extrémité C étendue de PhnG, qui à l'état fermé est située à l'extérieur du complexe de base de la lyase C – P et forme une interaction étroite avec l'extrémité N de PhnI en utilisant un petit motif β antiparallèle, est portée avec le PhnI N terminus lorsqu'il se déplace vers le site Zn2 + et se cache dans une poche de PhnJ (Fig. 4e). Ensemble, les extrémités PhnI et PhnG subissent donc des mouvements concertés, dans les deux cas de plus de 30 Å, un changement structurel qui a probablement plusieurs implications fonctionnelles importantes. Nous notons que l'implication des deux chaînes de PhnI dans la coordination de Zn2+ à l'état ouvert explique également, avec l'exigence de symétrie pour la liaison d'un dimère ABC, pourquoi le complexe de base de la lyase C – P doit être un dimère de PhnGHIJ, résolvant ainsi un long - énigme permanente concernant la raison de la structure d'ordre supérieur de la C – P lyase.

Dans ce travail, nous présentons les structures de plusieurs états du complexe central de la CP lyase d'E. coli lié aux modules ABC PhnK et PhnL montrant que ni leur interaction avec le noyau ni la liaison à l'ATP en soi n'altèrent la conformation de l'enzyme. Ceci est différent du rôle classique des modules ABC dans les transporteurs, où la liaison à l'ATP est connue pour induire un état plus compact ainsi que des changements dans le segment transmembranaire entraînant l'éversion et l'état ouvert vers l'extérieur22. Il apparaît donc que l'état fondamental stable du complexe central de la lyase C – P (c'est-à-dire celui observé en l'absence des modules ABC) est compatible avec la conformation liée à l'ATP de PhnK. Nous montrons également que la présence d'un dimère de PhnK sur le complexe central de la lyase C – P entraîne l'association d'un dimère similaire du module ABC homologue, PhnL, dans un arrangement double ATPase. Et surtout, nous avons pu montrer qu'in vivo et in vitro, l'activité des deux modules ABC est nécessaire au renouvellement de l'ATP. Bien que l'on ne sache toujours pas pourquoi et quand l'activité ATPase est requise lors de la dégradation des phosphonates, cette observation soulève plusieurs questions concernant l'activation des ATPases et si l'hydrolyse de l'ATP se produit simultanément ou séquentiellement dans les deux ensembles de protéines. La détermination de la structure dans des conditions de renouvellement de l'ATP nous a permis de capturer une structure fermée post-hydrolyse pour PhnK liée au complexe central et ADP + Pi. Pour les transporteurs ABC, cette conformation est difficile à capturer en raison de la libération rapide de Pi et d'énergie lors de l'hydrolyse de l'ATP23, donc ce résultat pourrait suggérer que PhnL sert à contrôler la libération de phosphate de PhnK et donc potentiellement fournit également une explication pour l'exigence de deux types de modules ABC.

PhnK et PhnL se lient dans la même orientation par rapport à leurs partenaires, le complexe central de lyase C – P et PhnK, respectivement, car les NBD correspondants lient les domaines transmembranaires dans les transporteurs ABC, mais la structure de la région d'interaction diffère dans les deux cas. de l'hélice de couplage typique trouvée dans les transporteurs ABC (Fig. 5). Dans les deux cas, l'interaction entre le NBD et son partenaire utilise une autre géométrie de liaison et semble nécessiter des éléments spéciaux, tels que l'épingle à cheveux β étendue dans PhnL et le domaine C terminal de PhnK (Figs. 2a, b et Fig. 5). Fait intéressant, ce domaine C-terminal se trouve souvent dans les modules ABC des transporteurs, tels que le transporteur multidrug Staphylococcus aureus, Sav1866 (Figs. 5a et 5d)24. Le double dimère de PhnK et PhnL observé dans la C – P lyase n'a, à notre connaissance, jamais été observé auparavant parmi les modules ABC et élargit donc considérablement le répertoire de la manière dont ces protéines peuvent interagir avec des partenaires. De plus, étant donné que le complexe central C – P lyase n'est pas lié aux segments transmembranaires des transporteurs, cela indique également que le pli global du partenaire de liaison ABC est moins important pour l'interaction que les interactions spécifiques à l'interface. Comme supposé ci-dessus, PhnL pourrait potentiellement fonctionner pour inhiber la libération de Pi par PhnK après l'hydrolyse et ainsi contrôler le moment où l'énergie générée par l'hydrolyse de l'ATP est libérée, susceptible de briser le complexe central, comme indiqué. La densité EM suggère que la région C-terminale de PhnK devient plus ordonnée en présence de PhnL (Fig. 10b, c supplémentaires). Cet effet s'étend vers l'hélice 6 et la boucle D, qui pourrait agir comme une porte pour contrôler la libération de Pi. Dans ce modèle, la stabilisation de la boucle PhnK D par PhnL empêcherait la libération de Pi.

a Aperçu de la structure du transporteur ABC de S. aureus Sav1866 dans la conformation liée à l'ADP avec le module ABC en vert et le domaine transmembranaire en gris, à l'exception de l'hélice de couplage, responsable de l'interaction entre les deux, qui est représentée en cyan (2HYD)24 b Aperçu de la structure du complexe central CP lyase avec un dimère de PhnK E171Q dans la conformation liée à l'ATP avec le dimère PhnK en rouge et le complexe central CP lyase en gris à l'exception du PhnJ Central Insertion Domain (CID) , responsable de la liaison PhnK, qui est représentée en bleu. c Aperçu de la structure du dimère PhnK ABC lié à PhnL en conformation ouverte avec le dimère PhnL en jaune et PhnK en gris sauf la région C-terminale, responsable de l'interaction, qui est représentée en rouge. d Détails du site de liaison à l'ATP du transporteur S. aureus Sav1866 ABC (lié à l'ADP). e Détails du site de liaison PhnK ATP (lié à AMPPNP). f Détails de l'ATP lié au site actif PhnL.

Étant donné que le complexe central C – P lyase est apparu monolithique dans toutes les structures précédentes, nous pensons que le réarrangement structurel d'une conformation fermée à une conformation ouverte est important et fournira de nouvelles façons de comprendre le processus catalytique complexe de dégradation des phosphonates par cette voie. Vraisemblablement, la nature inaccessible du site de liaison métallique entre PhnI et PhnJ empêche la dissociation du ligand à l'état fermé. Inversement, cela suggère également que l'ouverture du complexe et l'occupation complète de l'ion Zn2+ pourraient induire un échange de substrat. Et par extension, la liaison au substrat pourrait être une exigence pour la fermeture du complexe de cœur, ce qui expliquerait pourquoi il y a toujours une densité pour un ligand proche du Zn2+ à l'état fermé14. L'ensemble des résultats présentés ici nous permet donc de proposer un modèle des réarrangements structuraux se produisant dans la C – P lyase au cours d'une partie du cycle réactionnel (Fig. 6). Initialement, le complexe central serait dans un état fermé avec un substrat lié, PhnK dans l'état ATP et PhnL dans un état semi-ouvert (Fig. 6, en haut à gauche). Cela pourrait déclencher une réaction au site actif de l'enzyme ainsi qu'une hydrolyse de l'ATP sur PhnK. Les deux sous-unités PhnK seraient alors écartées, ouvriraient le complexe central et permettraient la fermeture de PhnL. Dans cet état, le site actif est ouvert et un échange substrat/produit peut avoir lieu (Fig. 6, en bas à droite). La liaison d'un autre substrat au site pourrait alors déclencher une nouvelle fermeture du noyau et une hydrolyse de l'ATP dans PhnL, suivie de l'ouverture du dimère PhnL.

Un modèle schématique illustrant un cycle fonctionnel possible pour la C – P lyase avec des états connus (observés) en couleurs et des états putatifs en gris. En haut à gauche, le complexe central C – P lyase ( PhnGHIJ , bleu) lie deux dimères de PhnK (rouge, à l'état lié à l'ATP) et PhnL (partiellement ouvert) ainsi qu'un substrat. Ce complexe peut se lier à l'ATP dans PhnL avant de déclencher éventuellement une réaction dans le complexe central et l'hydrolyse de l'ATP et la libération de Pi dans le dimère PhnK. L'hydrolyse de PhnK ATP provoque l'ouverture du noyau pour permettre la libération du produit tandis que les sous-unités PhnL sont autorisées à former un dimère fermé et le substrat est échangé. Après une nouvelle liaison au substrat, le noyau se ferme tout en rapprochant les deux sous-unités PhnK dans un état lié à l'ATP. Enfin, PhnL hydrolyse l'ATP, libère ADP + Pi et se sépare pour revenir à la position de départ.

À ce stade, cependant, on ne sait pas exactement au cours de quelle partie de la voie de transformation chimique ces réarrangements ont lieu, mais certaines preuves suggèrent qu'il pourrait s'agir de la toute première étape, qui s'est avérée impliquer à la fois PhnG, PhnH, PhnI et PhnL ainsi que l'ATP (Fig. 1 supplémentaire). Le mécanisme de réaction de la machinerie bactérienne C – P lyase est resté une énigme non résolue en biologie depuis sa découverte il y a plus de 35 ans2,13. La complexité chimique de la voie, la multitude de domaines protéiques et d'enzymes en interaction, leurs dépendances internes et l'exigence de conditions de réaction anaérobies se sont avérées une combinaison difficile. Cependant, des progrès constants ont été réalisés ces dernières années, tant du côté biochimique que structurel, et nous commençons lentement à révéler certains des secrets internes de ce système moléculaire fascinant8,14,15. Pour passer à autre chose, nous pensons qu'il sera important d'étudier l'enzyme dans des conditions anaérobies en utilisant des conditions d'expression douces qui permettent l'incorporation naturelle du cluster Fe4S4. De plus, il est possible que la fonction de la CP lyase soit liée à sa localisation intracellulaire. Par conséquent, pour obtenir une image complète, nous devons nous rapprocher le plus possible de l'état naturel et étudier la réaction telle qu'elle se produit à l'intérieur des cellules.

Le plasmide pHO575 codant pour PhnGHJIK avec une étiquette His C-terminale sur PhnK a été introduit dans la souche E. coli HO2735 (Δ(lac)X74 ΔphnCDEFGHIJKLMNOP 33–30/F lacIq zzf ::Tn10)14. Les cellules ont été cultivées dans un milieu Luria Bertani (LB) contenant 100 μg/mL d'ampicilline dans un incubateur à agitation à 37 °C jusqu'à ce qu'une DO600 de 0,5 soit atteinte, moment auquel l'expression génique a été induite à l'aide de 0,5 mM d'isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). L'expression a été effectuée pendant une nuit à 20 ° C, après quoi les cellules ont été recueillies par centrifugation, remises en suspension dans 50 mM HEPES / NaOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 20 mM imidazole, 5 mM MgCl2, 3 mM β-mercaptoéthanol (BME), 20 % (v/v) de glycérol et 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), lysés par sonication et centrifugés à 23 400 × g pendant 45 min à 4 °C. Le surnageant a été chargé sur une colonne His-Trap HP pré-équilibrée de 5 mL (Cytiva), lavé avec 50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 650 mM NaCl, 20 mM imidazole, 5 mM MgCl2, 3 mM BME et 20 % ( v/v) glycérol suivi de 50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 150 mM NaCl, 20 mM imidazole, 5 mM MgCl2, 3 mM BME, 20 % (v/v) glycérol et 50 mM imidazole avant élution dans le même tampon avec 300 mM d'imidazole. Les échantillons purifiés ont été chargés sur un Source 15Q (Cytiva) de 1 mL pré-équilibré avec HEPES/NaOH 50 mM pH 7,5, NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM et BME 5 mM, lavés et élués à l'aide d'un gradient linéaire de 100 à 800 mM. NaCl sur 20 volumes de colonne (CV). Les échantillons contenant du PhnGHIJK ont été dilués à ~ 100 mM NaCl avant d'être chargés sur une colonne MonoQ, pré-équilibrés dans 50 mM HEPES/NaOH pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 et 5 mM BME, avant l'élution à l'aide d'un gradient de 100 à NaCl 500 mM sur 36 CV. Les pics individuels ont été regroupés et concentrés à l'aide de filtres d'ultrafiltration Vivaspin 20 avant d'être chargés sur une colonne d'exclusion de taille Superdex 200 Augmentation 10/300 GL pré-équilibrée dans HEPES 50 mM pH 7, 5, NaCl 125 mM et BME 5 mM. Enfin, les fractions de pointe ont été stockées sur de la glace jusqu'à leur utilisation pour les grilles cryo-EM.

Les grilles Cryo-EM (grilles de cuivre C-Flat 1.2/1.3 400 mesh, Protochips) ont été déchargées pendant 90 s à 10 mA à l'aide d'un système GloQube (Quorum Technologies) immédiatement avant d'appliquer 3 μL de Phn(GHIJ)2K purifié (1,7 mg/mL), buvardage (6 à 7 s) et congélation par plongée dans de l'éthane liquide à l'aide d'un congélateur à plongée Leica EM GP2 réglé sur 5 °C, 100 % d'humidité et une température d'éthane de −184 °C. Les données EM ont été collectées au Electron Bio-Imaging Center (eBIC) à Diamond Light Source, Royaume-Uni sur un Titan Krios 300 keV avec un détecteur d'électrons direct (Gatan K3), un filtre d'énergie fonctionnant avec une largeur de fente de 20 eV en utilisant SerialEM25 pour l'acquisition des données. 17 088 films ont été collectés avec une exposition de 0,2 s par image sur 40 images avec une dose de 1,3 e−/Å2/image correspondant à une exposition totale de 52 e−/Å2, la défocalisation allant de −0,7 à −2,0 μm la valeur nominale le grossissement a été fixé à 135 000, ce qui donne une taille de pixel physique de 0,83 Å en mode comptage. La qualité de la collecte des données a été contrôlée en exécutant RELION-326 en mode streaming via relion_it.py.

La correction de mouvement basée sur les images a été effectuée à l'aide de l'implémentation RELION de MotionCor227, tandis que l'estimation CTF a été effectuée à l'aide de Gctf28 dans RELION-3. Des sous-ensembles des micrographies ont été utilisés pour la sélection laplacienne de gaussienne dans RELION-3 avant l'extraction avec 8, 75 fois le binning et la classification 2D. De bonnes classes 2D ont été utilisées comme modèles pour la sélection basée sur des modèles, après quoi ces particules ont été extraites en utilisant 6 fois le binning et une classification 2D a été effectuée pour éliminer les mauvaises particules. Les particules ont ensuite été ré-extraites en utilisant un regroupement 4 fois, suivi d'une génération initiale de modèle et d'une classification 3D. Les classes 3D résultantes ressemblant à PhnGHIJK comprenaient un empilement de 1 329 400 particules. Un deuxième cycle de classification 3D dans RELION-3 et de raffinement hétérogène dans cryoSPARC (Structura Biotechnology Inc.)29 a conduit à un empilement final de 901 800 particules. Ces particules ont ensuite été ramenées dans RELION-3.1 où elles ont été affinées davantage à l'aide du polissage bayésien, du raffinement CTF par particule, de l'estimation des aberrations d'ordre supérieur, de l'inclinaison du faisceau et du grossissement anisotrope30. Après auto-raffinement dans RELION-3.1, une résolution FSC avec masquage de 2,18 Å a été atteinte. La carte résultante montrait un grand détail du complexe central (PhnGHIJ), qui correspondait bien à la structure déterminée précédemment par cristallographie aux rayons X14, tandis que la sous-unité PhnK affichait une résolution locale significativement plus faible. Pour améliorer la structure de PhnK, une classification 3D avec soustraction de signal et variabilité 3D a été utilisée18,19 comme détaillé dans la Fig. 3 supplémentaire. La carte résultante avait une résolution FSC de 2,57 Å et une résolution locale améliorée pour PhnK. Un modèle initial a été construit en utilisant la structure publiée de Phn(GHIJ)2 (4XB6)14 et un modèle prédit de PhnK de Phyre231 pour la modélisation de corps rigide à l'aide de UCSF Chimera32. Ce modèle a ensuite été intégré à la carte à l'aide de Namdinator33 et construit manuellement dans Coot34 pour les régions de la carte avec une résolution plus élevée, tandis qu'ISOLDE35 a été utilisé pour les régions de résolution et d'interprétabilité inférieures. Le modèle final a été affiné et validé à l'aide du raffinement de l'espace réel Phenix36,37.

pRBS01 pour l'expression de Phn(GHIJKL)2 a été construit à l'aide de l'assemblage Gibson38 par amplification de phnGHIJKLMNOP à partir de pBW12039 et insertion d'une séquence codant pour une étiquette TEV-2xStrep à l'extrémité 3 'de phnK (voir les tableaux supplémentaires 2 et 3 pour les plasmides et les amorces utilisé dans ce travail). pET28a linéarisé a été préparé par PCR en utilisant les amorces RBS01 et RBS02, tandis que le site TEV-2x-Strep a été préparé à partir d'une séquence gBlock en utilisant les amorces RBS03 et RBS04. Les deux fragments contenant les gènes phn ont été préparés à partir de pBW120 en utilisant les amorces RBS05 + RBS06 (phnGHIJK) et RBS07 + RBS08 (phnLMNOP), respectivement. Le plasmide linéarisé a été mélangé avec un excès de 2 à 3 fois des trois fragments d'insert, suivi de l'ajout de Gibson Assembly® Master Mix (New England Biolabs) et d'une incubation à 50 ° C pendant 60 min. Les plasmides assemblés ont été transformés dans des cellules compétentes NEB 10-β de la souche E. coli (New England Biolabs) et étalés sur de la gélose LB contenant 50 μg/mL de kanamycine. Des mutants PhnK/PhnL ont été construits par PCR en utilisant pRBS01 comme matrice et ensembles d'amorces SKA01 + SKA02 (PhnK E171Q) et SCO01 + SCO02 (PhnL E175Q). Le double mutant a été construit en utilisant ces deux ensembles d'amorces dans des réactions de mutagenèse PCR séquentielles.

Pour l'analyse cryo-EM, pRBS01-PhnK E171Q a été transformé dans des cellules E. coli Lemo21 compétentes (New England Biolabs). Les cellules ont été cultivées dans un milieu LB contenant 300 μM de L-rhamnose, 34 μg/mL de chloramphénicol et 50 μg/mL de kanamycine jusqu'à une DO600 d'environ 0, 5 avant l'ajout de 1 mM d'IPTG. Les cellules ont été incubées à 37 °C pendant 3 à 4 h avant la récolte. Les cellules collectées ont été remises en suspension dans un tampon de lyse contenant 25 mM HEPES/KOH pH 7,5, 125 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 % de glycérol, 5 mM BME, 1 μg/mL DNase I, 1 mM PMSF et 5 μM adénosine-5′ -[(β-γ)-imido]triphosphate (AMPPNP) et lysé par sonication. Le lysat a été clarifié par centrifugation à 23 400 × g pendant 45 min à 4 ° C et chargé sur une colonne StrepTrap HP de 1 ml (Cytiva) qui était maintenue à 8 ° C et avait été pré-équilibrée dans un tampon de lyse. La colonne a été lavée avec 10 CV d'un tampon de lavage StrepTrap (25 mM HEPES/KOH pH 7,5, 125 mM KCl, 5 mM MgCl2, 5 mM BME et 5 mM AMPPNP) avant élution avec 5 CV de ce tampon dont 2,5 mM D -desthiobiotine. Les fractions pertinentes ont été analysées par SDS-PAGE et stockées sur de la glace.

Les grilles UltrAuFoil 0,6/1 ont été luminescentes (10 mA, 90 s, GloQube, Quorum) immédiatement avant de distribuer 3 μL de protéine fraîchement purifiée diluée dans un tampon de lavage StrepTrap à une concentration de 2,5 mg/mL suivi d'un transfert (7 à 9 s) et congélation immédiate par plongée dans de l'éthane liquide à l'aide d'un congélateur à plongée Leica EM GP2, ajusté à 5 °C, 100 % d'humidité et une température d'éthane de -184 °C. Les données Cryo-EM ont été acquises à l'installation nationale danoise Cryo-EM (EMBION) - nœud AU (iNANO, Université d'Aarhus) sur un Titan Krios G3i (Thermo Fisher Scientific) fonctionnant à 300 keV à l'aide d'un détecteur d'électrons direct K3 (Gatan), un filtre énergétique Bioquantum (Gatan) avec une largeur de fente de 20 eV et EPU (Thermo Fisher Scientific) pour la collecte automatisée des données. Les données ont été collectées en mode super résolution compté à un grossissement nominal de 130 000 avec une correction de gain à la volée suivie d'un binning 2 × en EPU, ce qui a entraîné une sortie de films à la taille de pixel physique (0, 647 Å / pixel). La hauteur eucentrique a été déterminée pour chaque carré de la grille et les données acquises en utilisant une plage de défocalisation de -0,5 à -1,4 μm et une fluence électronique de 62 e-/Å2 sur 56 images. La qualité des données a été contrôlée et initialement traitée via cryoSPARC Live.

Toutes les données ont été traitées dans cryoSPARC. Initialement, les micrographies ont été corrigées du mouvement des patchs, suivies d'une estimation et d'un filtrage du patch CTF à l'aide de divers indicateurs de qualité des données. Les particules ont d'abord été sélectionnées à l'aide d'un sélecteur de gouttes gaussien, après quoi 4 × particules regroupées ont été extraites et soumises à une classification 2D. Les particules de bonnes classes 2D ont été conservées et un travail de prélèvement manuel utilisant un sous-ensemble de 14 micrographies a été lancé là où davantage de particules ont été prélevées. L'ensemble collecté de particules sélectionnées a été utilisé pour former le sélecteur profond, après quoi le modèle a été utilisé pour sélectionner les particules des 4502 micrographies restantes.

La stratégie de traitement des données est illustrée à la Fig. 4 supplémentaire. En bref, un total de 1 530 855 particules ont été extraites à l'aide du regroupement 4 × et soumises à une classification 2D, après sélection de bonnes classes 2D et reconstruction 3D ab initio à l'aide de cinq classes et raffinement hétérogène à l'aide du mêmes cours. Une classe présentant la structure Phn(GHIJKL)2 a été soumise à un raffinement homogène et les particules alignées ont été utilisées pour l'analyse de variabilité 3D19. Pour l'analyse de la variabilité 3D, trois modes principaux orthogonaux ont été déterminés avec une résolution filtrée à 5, 5 Å, les particules de différentes conformations ont été séparées en regroupant les particules à l'aide de leurs modes principaux en quatre groupes différents. Un cluster a été sélectionné et les particules de cette classe ont été utilisées pour la correction du mouvement local après extraction dans une boîte de 420 × 420 pixels de 1, 48 × et utilisées pour le raffinement avec une symétrie C2 imposée donnant une résolution FSC finale de 2, 09 Å de résolution pour 59 737 particules. Cette carte a ensuite été traitée en déterminant la résolution locale et lors du filtrage et de la netteté locaux à l'aide des données de résolution locale. Pour la construction du modèle, le complexe central PhnGHIJ et PhnK de la structure Phn(GHIJ)2K ont été ancrés individuellement dans la carte à l'aide de ChimeraX40, tandis qu'un modèle PhnL a été généré à l'aide de Phyre231. Le modèle a été encore amélioré par ajustement de carte à l'aide de Namdinator33, après correction des chaînes individuelles et ajout de ligands et d'ions à l'aide d'ISOLDE35. Le modèle a été inspecté dans Coot34 où des résidus supplémentaires ont été ajoutés lorsqu'ils étaient visibles sur la carte. Le modèle final a été affiné et validé à l'aide du raffinement en espace réel de Phenix36.

L'expression et la purification de Phn(GHIJKL)2 avec PhnK de type sauvage à partir de pRBS01 ont suivi le même protocole que le mutant PhnK E171Q. Après purification StrepTrap, l'échantillon a été traité avec la protéase TEV (protéase TEV 1:50 w/w) à 8 °C pendant la nuit, après quoi l'échantillon a été chargé sur une colonne MonoQ 5/50 (Cytiva), pré-équilibrée dans 25 mM HEPES/KOH, KCl 100 mM, MgCl2 5 mM, glycérol 10 %, BME 5 mM et AMPPNP 1 μM). La protéine a été éluée à l'aide d'un gradient de 200 à 450 mM de KCl sur 36 CV, après quoi les pics individuels ont été regroupés. L'échantillon Phn(GHIJKL)2 a été concentré à l'aide d'un filtre Vivaspin 20 et chargé sur une colonne Superdex 200 d'augmentation 10/300 (Cytiva) équilibrée dans 25 mM HEPES/KOH, 125 mM KCl, 0,5 mM EDTA, 5 mM BME et 0,25 mM ATP. La protéine purifiée a été concentrée et stockée à 4°C.

Un échantillon de Phn(GHIJKL)2 purifié (2,5 mg/mL) a été conservé sur de la glace et incubé avec de l'ATP à une concentration de 1,5 mM suivi d'un ajout de MgCl2 à une concentration de 6 mM pour activer la réaction ATPase, puis incubé pendant 15 s à 37 °C et immédiatement congelées par plongée sous décharge luminescente (10 mA, 90 s, GloQube, Quorum) Grilles UltrAuFoil 0,6/1 à l'aide d'un congélateur plongeant Leica EM GP2 réglé sur 37 °C, 100 % d'humidité et une température d'éthane de -184 ° C et un temps de transfert de 6 à 9 s. Les données ont été acquises de la même manière que pour Phn(GHIJKL)2-PhnK E171Q et traitées à l'intérieur de cryoSPARC. Les micrographies ont été corrigées du mouvement des patchs, suivies d'une estimation du patch CTF et filtrées à l'aide de divers indicateurs de qualité des données. Les particules ont d'abord été sélectionnées à l'aide d'un sélecteur de gouttes gaussien, après quoi 4 × particules regroupées ont été extraites et soumises à une classification 2D. Les particules des classes 2D claires ont été conservées et un travail de prélèvement manuel utilisant un sous-ensemble de 14 micrographies a été lancé là où davantage de particules ont été prélevées. L'ensemble collecté de particules sélectionnées a été utilisé pour former le sélecteur profond, après quoi le modèle a été utilisé pour sélectionner les particules des 3741 micrographies restantes.

Le traitement initial des données a été effectué comme pour l'ensemble de données Phn(GHIJKL)2-Phn E171Q, en utilisant 1 155 385 particules provenant de 3741 micrographies. La stratégie de traitement des données est illustrée dans les Figs supplémentaires. 8 et 9. Les particules sélectionnées ont été extraites à l'aide d'un binning 2,75 × et soumises à une classification 2D, après sélection de bonnes classes 2D. Les particules sélectionnées à partir de la classification 2D ont ensuite été utilisées pour la reconstruction 3D ab initio en utilisant quatre classes, et les particules des classes présentant des caractéristiques de type protéine ont ensuite été utilisées pour un raffinement non uniforme41. Les particules résultantes du raffinement non uniforme ont été soumises à une analyse de variabilité 3D19 pour séparer différentes conformations les unes des autres en utilisant trois modes principaux orthogonaux qui ont été déterminés avec une résolution filtrée à 6 Å, après quoi les particules de différentes conformations ont été séparées en 8 groupes différents par clustering selon les modes principaux obtenus. Pour la structure Phn (GHIJKL) 2 WT, deux clusters ont été sélectionnés et les particules correspondantes ont été soumises à une correction de mouvement local par particule et réextraites dans une boîte de 1, 29 × 480 × 480 pixels. L'ensemble final de 222 056 particules a ensuite été utilisé pour un raffinement non uniforme en utilisant la symétrie C2 pour obtenir la carte finale avec une résolution FSC de 1, 93 Å (Fig. 9a supplémentaire). Pour la conformation fermée Phn (GHIJK) 2, un cluster a été sélectionné et les particules ont été réextraites dans une boîte de pixels de 1, 42 × 386 × 386. L'ensemble final de 81 605 particules a été utilisé pour un raffinement non uniforme avec une symétrie C2, ce qui a donné une carte avec une résolution FSC de 1, 98 Å (Fig. 9b supplémentaire). Pour la conformation ouverte Phn(GHIJK)2, quatre clusters du premier cycle d'analyse de variabilité 3D ont été soumis à un autre cycle d'analyse de variabilité 3D et de regroupement. Un cluster a été sélectionné et les particules ont été réextraites dans une boîte de 1,42 × 386 × 386 pixels. L'ensemble final de 31 280 particules a été utilisé pour un raffinement non uniforme et a donné une carte avec une résolution FSC de 2, 57 Å (Fig. 9c supplémentaire). Cette carte a ensuite été traitée en déterminant la résolution locale et pendant le filtrage local et l'affinement de la carte à l'aide des données de résolution locale.

Pour la construction du modèle de Phn(GHIJKL)2 WT, le modèle final Phn(GHIJKL)2-PhnK E171Q a été initialement ancré dans la carte. Les ligands ont été échangés, les eaux ajoutées à l'aide de Phenix Douse36 et le modèle construit manuellement à l'aide de Coot et ISOLDE. Le modèle final a été affiné et validé à l'aide du raffinement en espace réel de Phenix. Au niveau du site de liaison Zn2+ dans PhnI, les longueurs de liaison du ligand ont été restreintes à l'aide des données de C. Lim et T. Dudev, 200042. Pour la conformation ouverte Phn(GHIJK)2, le modèle initial était basé sur la structure Phn(GHIJKL)2 de type sauvage , qui a été divisé en deux parties, l'une contenant PhnG2HI2JK et l'autre contenant PhnHJK, chacune représentant un côté du complexe à noyau ouvert, et les deux ancrées individuellement dans la carte à l'aide de ChimeraX. Le modèle a été reconstruit en utilisant ISOLDE et Coot, à l'exception des deux molécules PhnK et d'une partie de la molécule PhnJ, qui n'ont pas été modifiées en raison de la faible résolution locale. Le modèle final a été affiné et validé à l'aide du raffinement de l'espace réel Phenix, sans le raffinement des chaînes PhnK. Pour la conformation fermée Phn (GHIJK) 2, la structure Phn (GHIJKL) 2 sans PhnL a d'abord été ancrée dans la carte, les ligands ont été échangés et les eaux éliminées. Le modèle final a été affiné à l'aide du raffinement de l'espace réel Phenix.

Pour la complémentation, un plasmide (pSKA03) contenant l'intégralité de l'opéron phn, y compris la boîte pho, a été construit sur la base de pBW120 par élimination des séquences non essentielles. Initialement, deux grands fragments ont été créés par PCR, un squelette plasmidique utilisant les amorces SKA03 et SKA04 et un autre contenant l'opéron phn comprenant la boîte pho utilisant les amorces SKA05 et SKA06. Les produits ont été traités avec l'endonucléase de restriction DpnI et transformés ensemble (300 ng chacun) dans des cellules E. coli NovaBlue compétentes pour obtenir un clonage indépendant de RecA43. L'ADN plasmidique a été purifié à partir de clones positifs et confirmé par séquençage nucléotidique. Par la suite, les mutations ponctuelles PhnJ E149A, PhnJ Y158A, PhnK R78A/R82A, PhnK E171Q et PhnL E175Q ont été introduites par PCR en utilisant les amorces SKA07 et SKA08 pour PhnJ E149A, SKA09 et SKA10 pour PhnJ Y158A, SKA11 et SKA12 pour PhnK R78A/R82. Un , SKA13 et SKA14 pour PhnK E171Q, et SKA15 et SKA16 pour PhnL E175Q. Pour la complémentation, la souche d'E. coli knock-out phosphonate HO1488 (ΔphnHIJKLMNOP) a été utilisée. La souche HO1488 a été cultivée dans LB contenant 50 μg/mL de kanamycine jusqu'à une DO600 d'environ 0,3, concentrée par centrifugation et remise en suspension dans 200 μL de TSB glacé (10 % p/v PEG 3350, 5 % DMSO et 20 mM MgCl2 dans LB media) pour rendre les cellules compétentes pour la transformation de l'ADN par choc thermique avec l'ADN des plasmides mentionnés ci-dessus. Les cellules transformées ont été cultivées sur des plaques de gélose minimale MOPS contenant 0,2 % de glucose, 100 μg/mL d'ampicilline, 34 μg/mL de kanamycine et 0,2 mM de K2HPO4, de 2-aminoéthyl phosphonate, de méthyl phosphonate ou sans source de phosphate ajoutée.

Les complexes Phn(GHIJKL)2 purifiés par Strep-tag (type sauvage, PhnK E171Q, PhnL E175Q et PhnK E171Q + PhnL E175Q) ont été incubés à une concentration d'environ 200 nM avec 5 mM d'ATP dans 50 mM HEPES/KOH pH 7,5, 300 mM KCl, 10 mM MgCl2 et 5 mM BME à 30 ° C pendant la nuit. 100 μL d'une dilution 1:20 du mélange réactionnel ont été chargés sur une colonne MonoQ (Cytiva) pré-équilibrée dans 25 mM HEPES/KOH pH 7,5, 5 mM MgCl2 et 5 mM BME et élués en utilisant un gradient de 0 à 180 mM KCl sur 7 CV. La colonne a été calibrée avec des échantillons connus d'ATP, d'ADP, d'AMP et d'adénine pour permettre l'identification de produits de réaction potentiels. Le taux quantitatif d'hydrolyse de l'ATPase a été mesuré via un dosage enzymatique couplé effectué à 37 ° C dans 25 mM HEPES / KOH, 125 mM KCl, 0, 5 mM EDTA, 5 mM BME et 0, 25 mM ATP avec l'ajout de 1 mM de phosphoénolpyruvate, 350 μM NADH, 0,04 mg/mL pyruvate kinase, 0,1 mg/mL lactate déshydrogénase, 10 mM MgCl2 et ATP à une concentration finale de 1 ou 5 mM. La réaction a été initiée par l'ajout de 0,02 mg de type sauvage purifié par StrepTrap, PhnK E171Q, PhnL E171Q ou PhnK E171Q/PhnL E175Q double mutant dans un volume total de 0,35 mL, ce qui a donné une concentration finale en protéines de 0,057 mg/mL. La conversion de l'ATP en ADP a été calculée à partir des taux d'oxydation du NADH mesurés en utilisant un coefficient d'extinction de 6,2 L mM-1 cm-1 à 340 nm. La réaction a été suivie pendant 6 min et la vitesse de réaction a été mesurée en utilisant un ajustement linéaire à la dégradation du NADH en NAD+.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données structurelles générées dans cette étude ont été déposées dans la Protein Data Bank et la EM Data Bank sous les codes d'accession 7Z19 et EMDB-14445 (Phn(GHIJ)2K), 7Z16 et EMDB-14442 (Phn(GHIJKL)2 PhnK-E171Q : AMPPNP), 7Z15 et EMDB-14441 (Phn(GHIJKL)2 WT:ADP + Pi), 7Z18 et EMDB-14444 (Phn(GHIJK)2 WT:ATP fermé), et 7Z17 et EMDB-14443 (Phn(GHIJK)2 WT : ATP ouvert). Les données sources sont fournies avec ce document.

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Ce travail a été rendu possible grâce à l'accès au Centre néerlandais de nanoscopie électronique (NeCEN) de l'Université de Leiden, un centre Instruct-ERIC, avec l'aide de Ludo Renault, du Centre de bio-imagerie électronique (eBIC) de Diamond Light Source, Royaume-Uni, et le nœud d'Aarhus du Danish National Cryo-EM Facility (EMBION) (iNANO, Université d'Aarhus, Danemark). Les auteurs remercient également le cluster de microscopie électronique de l'Université d'Aarhus (EMCC), Thibaud Louis Antoine Dieudonné pour leur aide dans le test ATPase, et Mogens Johannsen et Camilla Bak Nielsen pour leur aide dans l'analyse différentielle UPLC-QTOF-MS des métabolites phosphorylés liés. Un soutien financier a été fourni par Instruct-ERIC (PID 1514) et une subvention de la Novo Nordisk Foundation (subvention n° NNF18OC0030646) à DEB

Søren K. Amstrup & Nicholas Sofos

Adresse actuelle : Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research, University of Copenhagen, Blegdamsvej 3B, DK-2200, Copenhagen N, Danemark

Département de biologie moléculaire et de génétique, Université d'Aarhus, Universitetsbyen 81, DK-8000, Aarhus C, Danemark

Søren K. Amstrup, Sui Ching Ong, Nicholas Sofos, Jesper L. Karlsen, Ragnhild B. Skjerning, Jan J. Enghild, Bjarne Hove-Jensen et Ditlev E. Brodersen

Centre interdisciplinaire de nanosciences (iNANO) Université d'Aarhus, Gustav Wieds Vej 14, DK-8000, Aarhus C, Danemark

Thomas Bösen

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SKA, SCO, NS, BHJ et DEB ont conçu et SKA, SCO, NS, JJE et RBS ont réalisé les expériences ; NS, SKA et TB ont recueilli des données EM ; NS a déterminé la structure EM initiale de Phn(GHIJ)2K à une résolution inférieure avec l'aide de JLK, tandis que SKA a déterminé toutes les structures à haute résolution et a effectué le raffinement et la validation de la structure ; SKA et DEB ont rédigé le brouillon du manuscrit et produit des figures, et tous les auteurs ont révisé le texte.

Correspondance à Ditlev E. Brodersen.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Andrew Hitchcock et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Réimpressions et autorisations

Amstrup, SK, Ong, SC, Sofos, N. et al. Remodelage structurel de la machinerie carbone-phosphore lyase par une double ABC ATPase. Nat Commun 14, 1001 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36604-y

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Reçu : 03 mai 2022

Accepté : 08 février 2023

Publié: 22 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-36604-y

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