Blog

May 31, 2023

Développement de la boucle environnementale

Parasites et vecteurs

Parasites & Vecteurs volume 16, Numéro d'article : 78 (2023) Citer cet article

988 accès

5 Altmétrique

Détails des métriques

Les changements mondiaux modifient la répartition des maladies à transmission vectorielle en propageant les vecteurs dans des zones auparavant non endémiques. Depuis 2013, la schistosomiase urogénitale a fait son apparition en Corse et menace les pays européens. Les gastéropodes vecteurs libèrent des larves de schistosomes qui peuvent infecter les humains qui entrent en contact avec des plans d'eau douce. La surveillance des hôtes vecteurs de la schistosomiase est un préalable pour comprendre et par la suite contrôler cette transmission pathogène. Les enquêtes malacologiques étant chronophages et nécessitant une expertise particulière, l'utilisation d'une méthode moléculaire simple est souhaitable.

Le but de cette étude est de développer un protocole prêt à l'emploi utilisant la méthode LAMP (loop-mediated isothermal amplification) pour détecter l'ADN environnemental de Bulinus truncatus, vecteur de Schistosoma haematobium. Fait intéressant, la méthode LAMP possède toutes les caractéristiques requises pour l'adaptabilité aux conditions de terrain, en particulier dans les pays à faible revenu : rapidité, simplicité, réactifs lyophilisés, faible coût et robustesse contre les inhibiteurs d'amplification de l'ADN. Nous avons testé cette nouvelle méthode sur des échantillons d'eau corse préalablement analysés par qPCR et ddPCR.

Nous démontrons que notre outil de diagnostic B. truncatus eLAMP (Bt-eLAMP) peut détecter l'eDNA de Bulinus truncatus aussi efficacement que les deux autres méthodes. Bt-eLAMP peut même détecter 1/4 des échantillons positifs non détectables par qPCR. De plus, le protocole complet Bt-eLAMP (prélèvement, pré-traitement de l'échantillon, amplification et révélation) ne nécessite pas d'équipement sophistiqué et peut être réalisé en 1h30.

La détection LAMP de l'ADN environnemental permet une surveillance sensible à grande échelle de la schistosomiase urogénitale possible en identifiant les zones potentiellement menacées. Plus généralement, la méthode eLAMP a un grand potentiel dans les maladies vectorielles et l'écologie.

Il est bien établi que les changements mondiaux augmentent le risque d'épidémies de maladies infectieuses [1,2,3]. Les vagues épidémiques successives au cours de la dernière décennie, telles que la pandémie de grippe porcine, de nombreuses épidémies de virus Ebola en Afrique de l'Ouest, l'épidémie de virus Zika de 2015 et la pandémie de COVID-19 ont toutes entraîné une mortalité et une morbidité importantes tout en se propageant dans plusieurs pays [2]. L'incidence des maladies à transmission vectorielle chez les humains et les animaux est influencée par le changement climatique et le mode de vie humain (par exemple, la migration, la pollution, l'urbanisation) [1, 4, 5]. Depuis plusieurs années, nombre d'entre eux émergent ou réémergent dans le monde. Par exemple, la répartition géographique du virus de l'encéphalite à tiques et l'incidence humaine augmentent dans toute l'Europe, y compris la France, dans des zones qui étaient auparavant non endémiques [6]. Bien que la schistosomiase soit une maladie liée à la pauvreté et au manque d'eau potable dans les ménages, l'infection schistosomienne a été identifiée dans le sud de l'Europe (France et Espagne) [7, 8]. Les gastéropodes vecteurs libèrent des larves de schistosomes qui peuvent infecter les humains qui entrent en contact avec des plans d'eau douce. À l'été 2013, > 106 cas ont été diagnostiqués en Corse, une île méditerranéenne française connue pour son attrait touristique [9, 10]. Depuis, quelques cas de transmission autochtone persistent année après année [11]. Pour de nombreuses maladies parasitaires, les changements globaux conduisent à une redistribution spatiale des vecteurs ou des hôtes intermédiaires qui transmettent les maladies et peuvent également conduire à l'émergence de maladies [12,13,14,15,16]. La cartographie des zones d'épidémie de maladies infectieuses est essentielle à la fois pour identifier les populations à risque d'infection et pour communiquer et avertir le public [17]. Concernant les maladies à transmission vectorielle, puisque la transmission dépend de la présence des vecteurs, la cartographie de leurs distributions spatiales est nécessaire pour le contrôle de la maladie. Il a été démontré dans plusieurs pays africains que les campagnes de lutte contre les mollusques jouent un rôle majeur dans le contrôle des maladies transmises par les mollusques (SMD) et que l'application régulière de molluscicides contribue probablement à l'élimination des SMD dans les zones à risque [18,19,20 ]. Cependant, la surveillance des SMD, en particulier celles transmises par les espèces d'escargots d'eau douce, est moins évidente. L'hétérogénéité spatiale et temporelle de la répartition des mollusques d'eau douce explique la difficulté d'établir ces cartes de risques [21, 22]. Les méthodes d'échantillonnage conventionnelles sont donc laborieuses et chronophages, et elles nécessitent des malacologues pour l'identification taxonomique, qui se fait de plus en plus rare ces dernières années avec l'essor de la biologie moléculaire. Par conséquent, il est actuellement très difficile de suivre les populations d'escargots à grande échelle spatiale et temporelle [21, 22].

Le développement d'outils pour simplifier le suivi des SBD a été envisagé pour répondre à cette problématique, sur la base de l'ADN environnemental (eDNA) [23]. Des méthodes d'amplification d'ADNe ont été développées pour détecter de nombreux vecteurs parasites tels que Aedes albopictus [24] mais aussi des hôtes escargots tels que Galba truncatula et Austropeplea tomentosa [25, 26], les deux espèces étant impliquées dans la transmission de la douve du foie (Fasciola hepatica). La détection de l'ADNe est généralement effectuée à l'aide de la technique d'amplification quantitative de l'ADN par PCR. Plus récemment, la détection de l'eDNA d'Oncomelania hupensis et de Bulinus truncatus, impliqués dans la transmission de Schistosoma japonicum et Schistosoma haematobium, respectivement, a été rendue possible soit par PCR quantitative (qPCR), soit par PCR numérique en gouttelettes (ddPCR) [21, 27]. Les résultats obtenus dans ces dernières études ont montré une sensibilité et une spécificité de détection élevées. La détection de l'eDNA de B. truncatus par ddPCR a permis de trouver jusqu'à 0,06 copies/µl [21]. Cela représente une avancée significative dans le développement d'outils pour simplifier la surveillance SBD. Cependant, toutes ces techniques nécessitent un équipement sophistiqué et coûteux à la fois pour la préparation des échantillons (c'est-à-dire l'utilisation de kits d'extraction d'ADN coûteux et chronophages pour obtenir de l'eDNA sans inhibiteurs de PCR) et l'équipement d'amplification (c'est-à-dire LightCycler ou ddPCR). Ces techniques coûteuses nécessitent un laboratoire bien équipé, rarement disponible dans les zones d'endémie schistosomienne. Le développement d'outils rentables et adaptés au terrain pour la réalisation de cartes de répartition des mollusques est encore nécessaire [17, 23, 28]. La technique d'amplification isotherme médiée par la boucle (LAMP) a le potentiel de rendre cela possible [29,30,31]. Fait intéressant, la méthode LAMP possède toutes les caractéristiques requises pour l'adaptabilité aux conditions de terrain, en particulier dans les pays à faible revenu : rapidité, simplicité, réactifs lyophilisés, faible coût et robustesse contre les inhibiteurs d'amplification de l'ADN [29, 30, 32]. En effet, en utilisant une enzyme polymérase Bst à activité de déplacement de brin et quatre à six amorces s'hybridant sur six à huit régions de la séquence cible, la réaction d'amplification exponentielle de l'ADN peut être réalisée à température constante, sans dénaturation préalable des doubles brins d'ADN. En effet, l'hybridation des amorces va créer des structures tige-boucle sur les brins nouvellement amplifiés conduisant à la multiplication exponentielle du nombre de nouvelles zones de départ d'amplification. On obtient finalement un frottis composé de plusieurs fragments de tailles variées qui forment une échelle après révélation par gel d'électrophorèse. Ainsi, la réaction est effectuée très rapidement (généralement < 1 h) à une température constante d'environ 63 °C dans un simple bloc chauffant [29, 31, 33]. Étant donné qu'aucun équipement volumineux ou coûteux n'est requis pour effectuer un LAMP, des études récentes se sont concentrées sur le développement d'appareils portables pour effectuer un diagnostic sur le terrain aussi près que possible du site d'échantillonnage [34,35,36,37]. En raison de sa robustesse contre les inhibiteurs, elle peut être réalisée sur des échantillons avec une préparation très simplifiée, sans avoir besoin de kits d'extraction d'ADN pour purifier l'ADN, ce qui peut également être fait sur le terrain [38, 39]. L'amplification de l'ADN peut être détectée par visualisation à l'œil nu, électrophorèse sur gel ou fluorescence en temps réel, offrant une flexibilité d'utilisation sur le terrain [34, 36]. Des études récentes ont montré qu'il est possible de détecter l'eDNA par LAMP [40,41,42,43]. Une LAMP environnementale (eLAMP) a été développée pour détecter la présence de bactéries fécales indicatrices dans l'eau en 1 h, sans équipement de laboratoire sophistiqué ni personnel hautement qualifié [40]. Deux équipes ont réussi à amplifier l'eDNA de mollusques (Galba truncatula et Dreissena sp.) à partir d'échantillons d'eau avec LAMP [41, 42].

Le but de cette étude est de développer un outil de diagnostic rapide LAMP pour détecter l'ADN environnemental de Bulinus truncatus, hôte intermédiaire de Schistosoma haematobium. La schistosomiase est la deuxième maladie parasitaire la plus fréquente après le paludisme et reste une maladie tropicale négligée. Malgré son incidence élevée (230 millions de personnes infectées et 200 000 décès par an [44]), les efforts pour mener des campagnes de lutte contre les mollusques sont très faibles [28, 45, 46]. Cependant, en 2017, l'OMS a appelé à se recentrer sur la lutte contre les escargots pour soutenir les progrès, appelant les États membres à élaborer ou à adapter des stratégies nationales de lutte antivectorielle, visant à réduire l'incidence des maladies à transmission vectorielle, y compris la schistosomiase, d'au moins 40 % d'ici 2025. [46]. Ainsi, des outils rentables et adaptés au terrain pour une cartographie rapide de la distribution des mollusques sont nécessaires pour cette maladie [23]. Comparé aux méthodes d'amplification qPCR ou ddPCR, l'eLAMP semble avantageux pour l'applicabilité sur le terrain dans les pays à faible revenu. Cependant, cet avantage disparaît si le protocole d'extraction d'ADN qui précède l'amplification n'est pas adapté aux conditions de terrain comme l'utilisation de kits d'extraction d'ADN. Notre travail a consisté en (i) développement d'un test eLAMP spécifique à B. truncatus, (ii) comparaison des résultats obtenus par LAMP sur une banque d'ADNe avec ceux obtenus par qPCR et ddPCR et (iii) développement d'un protocole complet adapté au terrain de détection.

L'outil de diagnostic Bulinus truncatus eLAMP (Bt-eLAMP) a été développé à la fois à partir d'une banque d'ADN environnemental (eDNA) et d'ADN nouvellement extrait de mollusques.

La banque d'ADNe est composée de 200 échantillons précédemment collectés sur l'île de Corse, France [21]. Ces échantillons étaient de l'ADN extrait de membranes de filtration d'eau prélevées dans deux rivières distinctes du sud de la Corse. La transmission de la schistosomiase urogénitale a récemment été mise en évidence dans ces deux rivières [9, 10, 47]. Trois volumes d'eau différents (1, 3 et 5 l) provenant à la fois de la rive et du lit des rivières ont été collectés. Quatre sites ont été échantillonnés dans la rivière Cavu : les sites du pont Mulinu et du parc Tyroliana (échantillonnés en double), le site des trois mares où B. truncatus est présent et le site de prise d'eau où B. truncatus est absent. Un seul site a été échantillonné dans la rivière Solenzara où B. truncatus est présent. Des contrôles négatifs ont été effectués en filtrant l'eau de source pure le long de la rivière. En plus de ces sites d'échantillonnage en Corse, l'eDNA a également été prélevé à partir d'un canal artificiel au sein du campus de l'Université de Perpignan, où B. truncatus n'a jamais été enregistré, en tant que contrôle négatif. Le protocole d'extraction d'ADNe à partir des membranes de filtration d'eau résultantes a été décrit précédemment [21] et est brièvement rappelé ici : chaque membrane de filtration a été divisée en quatre quarts et extraite à l'aide du kit DNeasy® Blood & Tissue (QIAGEN). Sur les 200 échantillons, 144 échantillons d'ADNe ont été collectés là où B. truncatus étaient présents et 56 échantillons d'ADNe collectés là où B. truncatus n'étaient pas présents, et ils ont été amplifiés par qPCR. Un échantillon était considéré comme positif si au moins un quart de membrane était positif. Les réactions ddPCR ont été conduites sur des pools d'extraits d'ADN des quatre quarts de chaque membrane (soit 50 réactions) [21]. Les résultats par membrane obtenus avec qPCR et ddPCR ont été comparés à eLAMP (présente étude). Les résultats par quart de membrane obtenus par qPCR ont également été comparés à eLAMP.

En plus des eDNA, et pour tester la spécificité de nos ensembles d'amorces, l'ADN d'escargots d'eau douce (Bulinus sp. et d'autres genres phylogénétiquement apparentés) a également été extrait à l'aide du kit DNeasy® Blood & Tissue (QIAGEN) en suivant le protocole d'extraction tissulaire. En bref, après avoir broyé chaque escargot, les échantillons ont été placés dans un Speedvac™ DNA 130 (Savant™, Thermo Scientific™) à 65 °C pendant 20 min pour éliminer tout résidu d'alcool ou d'eau. Les escargots ont ensuite été lysés à 56 °C pendant 4 h dans une solution contenant 20 ml de protéinase K et 180 ml de tampon ATL. Les étapes restantes ont été effectuées conformément aux instructions du fabricant. La concentration d'ADN a été mesurée à l'aide d'un fluorimètre Qubit® 2.0. Ces derniers ADN ont été dilués avec de l'eau ultra pure pour obtenir des concentrations finales de 0,5 ng/µl. Les extraits d'ADN résultants et les dilutions ont ensuite été stockés à -20 ° C jusqu'à leur utilisation.

La sélection des cibles ADN a été exhaustive afin de maximiser les chances de succès du développement de l'outil de diagnostic eLAMP. L'ITS2 ; 5,8S; 18S ; COI ; et 28S Les régions d'ADN de B. truncatus ont été téléchargées à partir de la base de données GenBank (NCBI, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ ; numéros d'accès : MH361757 pour 5,8S ; KJ157340 pour 18S [48] ; KJ157370 pour 28S [48] ; MT707426 pour COI [49] et MG757890 pour ITS2 [50]). Lorsqu'elles étaient disponibles, les séquences d'autres espèces de Bulinus ont été téléchargées à partir de la base de données GenBank pour développer un outil de détection spécifique à B. truncatus. La conception des jeux d'amorces a été réalisée à l'aide du logiciel Primer Explorer V5 (Eiken Chemical Co., Ltd., Japon; http://primerexplorer.jp/e/) en suivant les critères décrits dans "A Guide to LAMP primer designing" (https ://primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.html). Les ensembles devaient respecter les paramètres suivants : longueur de chaque amorce entre 18 et 22 pb ; Tm entre 64 et 67 °C pour le couple F1c/B1c ; Tm entre 59 et 62 °C pour les couples F2/B2 et F3/B3 ; Taux de GC entre 50 et 65% ; Seuil dG < –4 kcal/mol pour la stabilité 5' et 3' et entre 0 et –1 kcal/mol pour le contrôle des dimères. L'estimation des dimères d'amorces et la stabilité de chaque ensemble d'amorces ont été vérifiées en ligne à l'aide du "Multiple Primer Analyzer" (Thermo Scientific Web Tool) et de l'outil OligoAnalyzer™ (IDT™). Toutes les amorces sélectionnées ont été synthétisées par Eurogentec (Seraing, Belgique).

Pour chaque jeu d'amorces conçu, plusieurs tests d'amplification ont été effectués en ajustant les paramètres de réaction d'amplification (c'est-à-dire MgSO4, amorces et concentration de bétaïne, temps de réaction et température). Le protocole retenu était le suivant : un volume total de 10 µl contenant 1,2 µM des amorces internes FIP et BIP, 0,2 µM des amorces externes F3 et B3, 0,4 µM des amorces LOOP LB et LF, 1,0 mM de chaque dNTP ( New England Biolabs), tampon de réaction 1X Isothermal Amplification Buffer II [20 mM Tris–HCl, 10 mM (NH4)2SO4, 150 mM KCl, 2 mM MgSO4, 0,1 % Tween® 20, pH 8,8 à 25 °C (Nouveau England Biolabs, Royaume-Uni)], 3 mM de MgSO4 supplémentaire (New England Biolabs, Royaume-Uni), 1,2 M de bétaïne et 1 U d'ADN polymérase Bst 2.0 WarmStart (New England Biolabs, Royaume-Uni) ainsi que 2,5 µl de matrice d'ADN. Les tubes de réaction ont été placés dans un bloc chauffant fonctionnant sur batterie à 63 °C pendant 45 min suivi d'une phase d'inactivation enzymatique à 80 °C pendant 5 min si les résultats n'étaient pas visualisés immédiatement après la réaction. Les visualisations des résultats ont été réalisées selon différents protocoles classiquement utilisés dans l'amplification d'ADN LAMP : (i) détection visuelle du point final de la fluorescence après ajout de 2 μl de SYBR Green (Invitrogen) dilué à 1:50 fois (vert : positif ; orange : négatif ); (ii) détection visuelle du point final des produits LAMP sur une électrophorèse sur gel d'agarose à 2 % avec 2 µl de MIDORI Green Advance (Nippon Genetics) pour 50 ml de gel d'agarose, révélé par les UV ; (iii) détection en temps réel en incorporant Sybr-Green 0,25 × dans le mélange réactionnel et en surveillant l'amplification dans un appareil portable Genie III (Optigene Ltd).

La spécificité de tous les ensembles d'amorces conçus a été évaluée sur des matrices d'ADN de 12 espèces d'escargots d'eau douce (tableau 1), y compris quatre spécimens du même genre mais d'espèces différentes (c'est-à-dire B. forskalii, B. globosus, B. umbilicatus et B. senegalensis) et d'autres genres apparentés phylogénétiquement. Bulinus truncatus de cinq localités différentes (tableau 1) ont été évalués pour visualiser une éventuelle variabilité intraspécifique. Seul le jeu d'amorces amplifiant exclusivement l'ADN de B. truncatus a été conservé pour les expériences suivantes.

La limite de détection (LOD) a été évaluée par des tests LAMP sur l'ADN de B. truncatus dilué dix fois en série de 10 ng/µl à 1,10–9 ng/µl avant et après l'ajout d'amorces LOOP à la réaction. À partir de la concentration d'ADN limite de détection obtenue, le nombre de copies cibles de B. truncatus par microlitre a été estimé à l'aide de l'équation suivante :

où Nc = le nombre de copies cibles de B. truncatus par microlitre ; C = concentration d'ADN de détection limite en ng/µl ; V = volume (ici, 1 µl) ; M = masse molaire moyenne d'une base azotée = 309 g/mol ; Sg = taille du génome de B. truncatus = 1.2.109 pb ; NA = numéro d'Avogadro ; NrDNA = nombre moyen de copies d'ADNr dans un génome = 93 copies [51,52,53,54,55,56].

Nous avons développé un nouveau protocole de concentration d'ADNe convivial sur le terrain nous permettant de tirer pleinement parti des avantages de LAMP sur le terrain. L'eau est recueillie dans une bouteille commerciale en plastique propre à la surface du plan d'eau. Ensuite, 500 ml à 1500 ml d'eau sont filtrés le long de la rivière à l'aide d'une unité de filtration 0,45 µm (PES VWR 1L 514-0301) et d'une pompe manuelle. L'eau est filtrée jusqu'à ce que la membrane soit obstruée par l'accumulation de sédiments. La membrane est coupée en quatre quarts avec une lame de scalpel et déposée dans un seul tube Falcon™ de 25 ml contenant 15 ml de tampon de lyse [NaCl 100 mM, EDTA 250 mM, SDS 5 % et Tris–HCl 10 mM (pH = 8) ]. Les pinces utilisées pour retirer les membranes des unités de filtration sont décontaminées avant chaque prélèvement en les plaçant successivement dans un bain d'eau de javel à 10% pendant 15 s puis 15 s dans une solution DNA AWAY™ (Thermo Scientific). Après agitation vigoureuse, le liquide est recueilli avec une seringue de 20 ml. Le liquide est préfiltré avec une membrane de 40 µm pour éliminer les plus gros sédiments, puis filtré avec un filtre seringue Whatman® GD/XP de 0,45 µm (13 mm) (PTFE Sigma Aldrich WHA69742504). Le dernier filtre est lavé avec 5 ml d'eau distillée et séché avec le même volume d'air. L'eDNA est enfin récupéré par filtration inverse avec 500 µl d'eau ultra pure grâce à une seringue couplée à une aiguille de distribution conique 18 GA (Metcal).

Ce dernier protocole a été évalué dans deux plans d'eau sénégalais investigués en juillet 2022. Le site de Lampsar (16°06′29′′N ; 16°20′59′′O) et le site de Diama (16°12′36′′N ; 16°24′10′′O) sont tous deux situés le long du fleuve Sénégal dans la région de Saint-Louis au Sénégal. À chaque site, des échantillons d'eau ont été prélevés en trois exemplaires avec environ 10 m entre les prélèvements. Sept cents millilitres, deux fois 500 ml et trois fois 500 ml ont été collectés respectivement pour les sites de Lampsar et Diama. Sur chaque site, des contrôles négatifs ont été effectués en filtrant 1500 ml d'eau de source pure en suivant strictement la même procédure que pour les échantillons biologiques. La présence sur site de B. truncatus a été vérifiée par prélèvement de mollusques pendant 1 h par deux malacologues.

L'accord entre les résultats obtenus avec le LAMP nouvellement développé et le qPCR pour la détection de l'ADN de B. truncatus sur la bibliothèque d'ADNe de 200 champs a été analysé statistiquement en calculant une analyse du coefficient kappa à l'aide du package psych (version 2.2.9) dans le logiciel R. Les sensibilités de champ sur la banque d'ADNe ont été calculées avec un intervalle de confiance de 95 % à l'aide du package de statistiques (version 3.6.2) dans le logiciel R.

Au total, 18 ensembles d'amorces ont été conçus. Après ajustement des paramètres et évaluation de la sensibilité et de la spécificité, nous avons sélectionné le meilleur candidat qui cible le marqueur ITS2" (Tableau 2). Un fichier supplémentaire montre l'alignement de l'amorce sur la séquence ITS2 (voir Fichier supplémentaire 1). Primer dimer minimum dG for this était de –0,93 kcal/mol.

La spécificité de Bt-eLAMP a été évaluée en testant l'ADN extrait de 11 espèces non ciblées et de cinq mollusques ciblés de différentes localités. La figure 1a montre que seuls les cinq échantillons d'ADN de B. truncatus sont amplifiés. Le test de sensibilité (Fig. 1b) montre que la limite de détection est de 1 fg/µl (soit l'équivalent d'environ Nc = 0,07 copies par microlitre) avec un jeu d'amorces complet (y compris les amorces LOOP). La limite de détection était de 1 pg/µl avant l'ajout des amorces LOOP.

Spécificité et LOD (limite de détection) du test Bulinus truncatus eLAMP (Bt-eLAMP). Résultats obtenus par électrophorèse sur gel d'agarose après 45 min de réaction. une Spécificité ; voies 1 à 5, matrices d'ADN de Bulinus truncatus provenant de cinq localités différentes (Diama, Lampsar, Mbane, Corse et Saneinte) ; piste 6, Bulinus globosus; piste 7, Bulinus senegalensis; piste 8, Bulinus forskalli; piste 9, Bulinus umbilicatus; piste 10, Biomphalaria glabrata; piste 11, Bithynia tentaculata; piste 12, Ancylus fluviatilis; piste 13, Gyraulus laevis; piste 14, Physa acuta; piste 15, Potamopyrgus antipodarum; piste 16, Pisidium casertanum; piste C+, contrôle positif (ADN de Bulinus truncatus ; 1 ng) ; piste C-, témoin négatif (eau comme matrice). b LD ; voies 1 à 11, dilutions en série d'ADN de Bulinus truncatus (10 ng/μL à 1 g/μl) ; piste C-, témoin négatif (eau comme matrice)

La figure 2 montre la comparaison de la précision de détection entre les méthodes d'amplification LAMP, qPCR et ddPCR sur des échantillons d'ADNe prélevés dans deux rivières corses. La méthode Bt-eLAMP a fourni les mêmes résultats que ceux obtenus avec la qPCR et la ddPCR. Toutes les membranes sont positives à l'exception de la membrane "1LStreambed" du site Mulinu bridge two. Aucun signal positif n'a été détecté à partir des six témoins négatifs de terrain ou du site de l'Université où B. truncatus n'a jamais été présent ou pour les échantillons prélevés sur le site de prise d'eau de la rivière Cavu où aucun B. truncatus n'a été collecté (Fig. 2). Compte tenu des résultats obtenus par quart de membrane où B. truncatus était présent, 110 des 144 échantillons ont été amplifiés avec succès avec LAMP ; pendant ce temps, 91 des 144 échantillons ont été amplifiés avec succès avec qPCR. Les sensibilités des méthodes LAMP et qPCR ont été estimées à 76,4 % (IC à 95 % 68,6-83,1) et 63,2 % (IC à 95 % 54,8-71,1), respectivement. L'accord Kappa obtenu avec ces résultats est égal à 0,51 (tableau 3).

Comparaison de la détection de l'ADN environnemental de Bulinus truncatus par amplification isotherme médiée par boucle (LAMP), amplification en chaîne par polymérase quantitative (qPCR) et amplification en chaîne par polymérase numérique en gouttelettes (ddPCR). Chaque cellule représente les résultats d'amplification d'ADN à partir d'eDNA collectés dans deux rivières corses (Cavu et Solenzara) et le Canal de Perpignan ; Les escargots Bulinus truncatus sont présents dans tous les sites à l'exception du site de prise d'eau dans la rivière Cavu et du site universitaire dans le Canal de Perpignan. Trois volumes d'eau (1, 3 et 5 l) provenant à la fois de la rive et du lit des rivières ont été collectés sur l'ensemble des sites corses. Chaque ligne représente le résultat d'amplification de chaque site en utilisant la méthode d'amplification LAMP, qPCR ou ddPCR. Les résultats de la qPCR et de la ddPCR proviennent de Mulero et al. [21]. Une membrane verte signifie qu'au moins un quart de la membrane de filtration est positif pour la présence de Bulinus truncatus et une membrane rouge signifie qu'aucun quart de la membrane de filtration n'est positif. Les cellules vides signifient qu'aucune filtration n'a été effectuée dans ces conditions

L'utilisation de l'amplification LAMP comme méthode de détection conviviale sur le terrain a été améliorée en développant un nouveau protocole de concentration d'ADNe qui pourrait être effectué le long des plans d'eau. L'ensemble du protocole a été testé sur les sites de Lampsar et Diama au Sénégal. Dans ces deux sites, respectivement 95 et 229 B. truncatus ont été prélevés par deux malacologues pendant 1 h de prélèvement. Quatre des 95 B. truncatus échantillonnés sur le site de Lampsar ont émis des cercaires après 2 h d'exposition à la lumière. Bulinus globosus était présent sur les deux sites. Bulinus forskalii n'était présent que sur le site de Diama, tandis que nous n'avons trouvé Biomphalaria pfeifferi que sur le site de Lampsar. Les trois échantillons d'ADNe des deux sites étaient positifs (Fig. 3) montrant une précision de 100 % de la méthode. Aucun des témoins négatifs n'était positif. Des échantillons d'ADNe de B. truncatus ont été amplifiés en moyenne 12 min après l'amplification des contrôles positifs (ADN extrait de B. truncatus).

Amplification isotherme médiée par une boucle en temps réel de l'ADN environnemental de Bulinus truncatus dans les sites de Diama (a) et Lampsar (b), Sénégal. Les lignes orange, jaune et verte sont des échantillons testés. Les lignes turquoises et bleues sont des témoins positifs (1 ng d'ADN extrait de B. truncatus). La ligne rouge correspond à l'échantillon négatif de terrain (filtration de 1500 ml d'eau minérale). Les lignes violettes et roses sont des échantillons négatifs en laboratoire (eau ultra pure)

Les changements mondiaux modifient la répartition des maladies à transmission vectorielle en propageant les vecteurs dans des zones auparavant non endémiques. Par conséquent, le développement d'outils rentables et adaptés au terrain pour les cartes de distribution vectorielle est nécessaire [17, 28]. Dans la présente étude, nous avons développé un outil de diagnostic LAMP rapide pour détecter l'ADN environnemental d'un escargot d'eau douce vecteur (ie B. truncatus) d'un parasite tropical (ie S. haematobium). Notre Bt-eLAMP a amplifié avec succès une fraction de marqueur ADN ITS2 de B. truncatus après 45 min d'incubation à 63 °C. Les tests in vitro ont mis en évidence la haute sensibilité de la Bt-eLAMP avec une LOD égale à 1 fg/µl lorsqu'elle incluait des amorces LOOP. Considérant que la LOD était de 1 pg/µl avant l'ajout des amorces LOOP, nous en déduisons que l'ajout d'amorces LOOP permet un gain de sensibilité d'un facteur 1000. D'un point de vue méthodologique, cela souligne l'importance de concevoir des jeux d'amorces permettant inclusion d'amorces LOOP. Les limites de détection des techniques LAMP développées se situent généralement entre 100 et 0,1 fg/µl [43, 57,58,59]. Notre LOD est inférieure à la LOD précédemment évaluée pour la détection LAMP eDNA de l'escargot d'eau douce vecteur de la fasciolose (Galba truncatula) [41]. Ces derniers auteurs ont mesuré une LOD de 0,349 pg/μl [41]. Lors de l'estimation de l'équivalence en nombre de copies (0,07 copie par microlitre) avec le jeu d'amorces complet (c'est-à-dire y compris les amorces LOOP), nous avons trouvé une sensibilité proche de celle obtenue avec la ddPCR (0,06 copie par microlitre) [21]. Notre Bt-eLAMP a montré une sensibilité égale à celle de la ddPCR, qui est considérée comme la technique d'amplification d'ADN la plus sensible de toutes [60, 61].

Notre test Bt-eLAMP a montré une spécificité de 100 % pour B. truncatus, même en considérant des espèces d'escargots étroitement apparentées. Cela suggère que le test Bt-eLAMP est suffisamment robuste pour détecter l'ADNe de B. truncatus dans les zones où d'autres escargots coexistent sans risque de réactivité croisée. Notre outil peut également permettre la détermination des espèces entre B. truncatus et d'autres espèces de Bulinus telles que B. globosus, qui sont morphologiquement indiscernables. En revanche, l'utilité de cette haute spécificité pourrait être remise en question si l'on considère que certaines espèces sœurs de mollusques, comme B. globosus, pourraient également être impliquées dans la transmission de la schistosomiase urogénitale [62]. Il serait intéressant de développer également des outils de diagnostic eDNA permettant une détection pan-spécifique à la fois de B. truncatus et de B. globosus ou de toutes les espèces du genre Bulinus. La difficulté sera de trouver un équilibre entre des régions suffisamment conservées entre les espèces de Bulinus et suffisamment différentes des autres gastéropodes pour obtenir un jeu d'amorces spécifique au genre. Cette dernière tâche est plus difficile car le nombre d'amorces requises dans LAMP et les contraintes de positionnement entre elles sur la séquence cible augmentent la longueur de la séquence à trouver répondant à ces exigences.

Compte tenu de notre banque d'ADNe, la méthode Bt-eLAMP a fourni exactement la même capacité de détection globale par rapport à la qPCR ou à la ddPCR [21]. En considérant chaque quart de membrane, avec respectivement 76,4 % (IC à 95 % 68,6-83,1) et 63,2 % (IC à 95 % 54,8-71,1) de détection positive par LAMP ou qPCR, la méthode LAMP a montré une capacité de détection plus élevée que la qPCR [21] . Le coefficient kappa met en évidence une concordance modérée entre les deux méthodes. Quinze quarts de membrane sont négatifs en LAMP alors qu'ils sont positifs en qPCR ; à l'inverse, 34 quartiers de membrane sont négatifs en qPCR et positifs en LAMP. La présence d'inhibiteurs de PCR pourrait expliquer ces derniers résultats. En effet, il a déjà été prouvé que, contrairement à la qPCR, la LAMP est robuste contre les inhibiteurs [29, 63].

Le développement de méthodes d'amplification conviviales sur le terrain telles que LAMP doit s'accompagner du développement d'un prétraitement de l'échantillon adapté au terrain. L'utilisation de kits d'extraction d'ADN à faible rendement du fait de leur haut niveau de purification nécessite des appareils particuliers tels que des centrifugeuses, qui sont coûteux. Par conséquent, nous avons développé un nouveau prétraitement d'échantillon d'eau adapté au terrain pour concentrer l'eDNA. Le protocole d'échantillonnage et de pré-traitement a été réalisé en 45 min sur le terrain sans électricité, ce qui représente une avancée significative dans le suivi des SBD. Néanmoins, plusieurs améliorations peuvent être apportées à notre protocole, notamment sur l'étape de filtration de l'eau. La pompe manuelle utilisée limite la rapidité et la commodité du protocole puisqu'il fallait 30 min par échantillon pour filtrer difficilement 500 ml d'eau. Une pompe à eau à membrane alimentée par batterie de 12 V couplée à une capsule filtrante adaptée a été utilisée pour filtrer jusqu'à 50 l d'eau dans une enquête ADN ciblant les trématodes dans l'eau [64]. Pour améliorer encore la praticabilité et la rapidité du test Bt-eLAMP, une pompe à piles améliorée pourrait remplacer la pompe manuelle. La compatibilité entre une pompe motorisée et les unités de filtration utilisées dans notre protocole doit être testée.

Nous avons utilisé le Genie III pour obtenir nos résultats de terrain du Sénégal, qui est un outil de terrain utile, facilement transportable, fonctionnant sur batterie, permettant de visualiser la cinétique de la réaction. Couplé à des réactifs lyophilisés, ce type de dispositif portable permet de réaliser l'ensemble du protocole (prélèvement, pré-traitement, amplification et révélation) sur le terrain [32]. Nous devrions utiliser un autre appareil portable pour les pays à faible revenu où l'utilisation du Genie III peut être un obstacle financier. La pandémie mondiale de COVID-19 a impliqué le développement de plusieurs outils pour effectuer des LAMP à faible coût et adaptés au terrain [34, 35, 65,66,67]. Un dispositif de diagnostic LAMP à faible coût et open source a été développé qui permet une amplification et une lecture de fluorescence en temps réel de la même manière que le Genie III [34]. Il a même été prouvé que la réaction LAMP peut se faire à l'aide d'une capsule de café remplie de matériau à changement de phase, appelée « T-cup », permettant une incubation à 63 °C dans de l'eau bouillante et une révélation à l'œil nu [35]. Dans une autre étude, l'étape de révélation d'un LAMP sur smartphone a pu être évaluée avec une application smartphone couplée à des filtres permettant la lecture de la fluorescence. A l'avenir, le test LAMP actuel devrait être amélioré avec des réactifs lyophilisés et ce type d'appareil puis testé sur un large échantillon.

Dans cette étude, nous avons développé un test LAMP complet adapté au terrain détectant la présence de l'ADN de l'hôte intermédiaire de l'escargot B. truncatus dans l'environnement. En raison des avantages de LAMP d'être convivial sur le terrain et de permettre des échantillons de prétraitement rentables, le test Bt-eLAMP peut être un nouvel outil précieux pour établir rapidement et efficacement des cartes de risque récurrentes de schistosomiase urogénitale. eLAMP a également été utilisé pour détecter la présence de parasites intestinaux dans les eaux usées lors du traitement, offrant même la possibilité de rechercher Schistosoma sp. eDNA directement [68]. Il serait nécessaire de développer des eLAMP pour d'autres espèces de Bulinus ou de Biomphalaria responsables de la transmission de Schistosoma. eLAMP pourrait également être développé pour d'autres SBD qui ont les mêmes pressions diagnostiques que la schistosomiase.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié.

Maladie transmise par les escargots

Amplification isotherme médiée par la boucle

Amplification isotherme médiée par la boucle environnementale

Réaction en chaîne par polymérase

Réaction en chaîne par polymérase quantitative

Réaction en chaîne par polymérase numérique de gouttelettes

ADN environnemental

Limite de détection

Contrôle positif

Contrôle négatif

Nii-Trébi NI. Maladies infectieuses émergentes et négligées : perspectives, avancées et défis. Biomed Res Int. 2017;2017:5245021.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Baker RE, Mahmud AS, Miller IF, Rajeev M, Rasambainarivo F, Rice BL, et al. Les maladies infectieuses à une époque de changement global. Nat Rev Microbiol. 2022;20:193–205.

Article CAS PubMed Google Scholar

Tredennick AT, O'Dea EB, Ferrari MJ, Park AW, Rohani P, Drake JM. Anticiper la réémergence et l'élimination des maladies infectieuses : un test des signaux d'alerte précoce à l'aide de modèles empiriques. Interface Soc JR. 2022;19:20220123.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Caminade C, McIntyre KM, Jones AE. Impact des changements climatiques récents et futurs sur les maladies à transmission vectorielle. Ann NY Acad Sci. 2019;1436:157–73.

Article PubMed Google Scholar

Allen T, Murray KA, Zambrana-Torrelio C, Morse SS, Rondinini C, Di Marco M, et al. Points chauds mondiaux et corrélats des maladies zoonotiques émergentes. Nat Commun. 2017;8:1124.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Gonzalez G, Bournez L, Moraes RA, Marine D, Galon C, Vorimore F, et al. Une approche à une seule santé pour enquêter sur une épidémie d'encéphalite alimentaire à tiques dans une zone non endémique en France (Ain, Est de la France) : une étude sérologique longitudinale dans le bétail, la détection chez les tiques et le premier isolement du virus de l'encéphalite à tiques et caractérisation moléculaire. Microbiol avant. 2022;13:863725.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Salas-Coronas J, Bargues MD, Lozano-Serrano AB, Artigas P, Martínez-Ortí A, Mas-Coma S, et al. Preuve de la transmission autochtone de la schistosomiase urinaire à Almeria (sud-est de l'Espagne) : analyse d'une épidémie. Travel Med Infect Dis. 2021;44:102165.

Article PubMed Google Scholar

Boissier J, Moné H, Mitta G, Bargues MD, Molyneux D, Mas-Coma S. Schistosomiasis reaches Europe. Lancet Infect Dis. 2015;15:757–8.

Article PubMed Google Scholar

Boissier J, Grech-Angelini S, Webster BL, Allienne JF, Huyse T, Mas-Coma S, et al. Epidémie de schistosomiase urogénitale en Corse (France) : une étude de cas épidémiologique. Lancet Infect Dis. 2016;16:971–9.

Article PubMed Google Scholar

Noël H, Ruello M, Maccary A, Pelat C, Sommen C, Boissier J, et al. Grande épidémie de schistosomiase urogénitale acquise en Corse du Sud, France : surveiller les premiers signes d'endémisation ? Clin Microbiol Infect. 2018;24:295–300.

Article PubMed Google Scholar

Berry A, Fillaux J, Martin-Blondel G, Boissier J, Iriart X, Marchou B, et al. Evidence for a permanent presence of schistosomiasis in Corsica, France, 2015. Euro Surveill. 2016. https://doi.org/10.2807/1560-7917.ES.2016.21.1.30100.

Article PubMed Google Scholar

El-Sayed A, Kamel M. Les changements climatiques et leur rôle dans l'émergence et la réémergence des maladies. Environ Sci Pollut Res Int. 2020;27:22336–52.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Giron S, Fournet N, Franke F, Brottet E, Calba C, Cochet A, et al. Bilan de la surveillance des Arbovirus en 2019 : passage à la surveillance des cas confirmés de Chikungunya, Dengue et Zika Virus en France métropolitaine. BEH. 2019;22:446–55.

Google Scholar

Musso D, DJ Gubler. Virus Zika. Clin Microbiol Rev. 2016;29:487–524.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mysterud A, Easterday WR, Stigum VM, Aas AB, Meisingset EL, Viljugrein H. Émergence contrastée de la maladie de Lyme dans les écosystèmes. Nat Commun. 2016;7:11882.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Millins C, Leo W, MacInnes I, Ferguson J, Charlesworth G, Nayar D, et al. Émergence de la maladie de Lyme sur Treeless Islands, Écosse, Royaume-Uni. Urgence Infect Dis. 2021;27:538–46.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Kraemer MUG, Hay SI, Pigott DM, Smith DL, Wint GRW, Golding N. Progrès et défis dans la cartographie des maladies infectieuses. Tendances Parasitol. 2016;32:19–29.

Article PubMed Google Scholar

Rollinson D, Knopp S, Levitz S, Stothard JR, Tchuem Tchuente LA, Garba A, et al. Il est temps d'établir le programme d'élimination de la schistosomiase. Acte Trop. 2013;128:423–40.

Article PubMed Google Scholar

King CH, Sutherland LJ, Bertsch D. Examen systématique et méta-analyse de l'impact des molluscicides chimiques pour le contrôle de la transmission de Schistosoma mansoni et S. haematobium. PLOS Negl Trop Dis. 2015;9:e0004290.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Sokolow SH, Wood CL, Jones IJ, Swartz SJ, Lopez M, Hsieh MH, et al. L'évaluation mondiale de la lutte contre la schistosomiase au cours du siècle dernier montre que le ciblage de l'hôte intermédiaire de l'escargot fonctionne le mieux. PLoS Negl Trop Dis. 2016;10:e0004794.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Mulero S, Boissier J, Allienne JF, Quilichini Y, Foata J, Pointier JP, et al. ADN environnemental pour la détection de Bulinus truncatus : un nouvel outil de surveillance environnementale pour l'évaluation du risque d'émergence de la schistosomiase. Environ ADN. 2020;2:161–74.

Article Google Scholar

Lamy T, Pointier J, Jarne P, David P. Tester la dynamique des métapopulations à l'aide de données génétiques, démographiques et écologiques. Mol Écol. 2012;21:1394–410.

Article CAS PubMed Google Scholar

Kamel B, Laidemitt MR, Lu L, Babbitt C, Weinbaum OL, Mkoji GM, et al. Détecter et identifier les infections à Schistosoma chez les escargots et les habitats aquatiques : une revue systématique. PLoS Negl Trop Dis. 2021;15:e0009175.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schneider J, Valentini A, Dejean T, Montarsi F, Taberlet P, Glaizot O, et al. Détection de moustiques vecteurs invasifs à l'aide d'ADN environnemental (eDNA) à partir d'échantillons d'eau. PLoS ONE. 2016;11:e0162493.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Jones RA, Brophy PM, Davis CN, Davies TE, Emberson H, Rees Stevens P, et al. Détection de l'ADN environnemental de Galba truncatula, Fasciola hepatica et Calicophoron daubneyi au sein des sources d'eau sur les pâturages, un futur outil de lutte contre la douve ? Vecteurs parasites. 2018;11:342.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Rathinasamy V, Hosking C, Tran L, Kelley J, Williamson G, Swan J, et al. Développement d'un test PCR quantitatif multiplex pour la détection et la quantification de l'ADN de Fasciola hepatica et de l'hôte intermédiaire d'escargot, Austropeplea tomentosa, dans des échantillons d'eau. Vétérinaire Parasitol. 2018;259:17.

Article CAS PubMed Google Scholar

Calata FIC, Caranguian CZ, Mendoza JEM, Fornillos RJC, Tabios IKB, Fontanilla IKC, et al. Analyse de l'ADN environnemental et des facteurs édaphiques pour la détection de l'hôte intermédiaire de l'escargot Oncomelania hupensis quadrasi. Agents pathogènes. 2019;8:1

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kincaid-Smith J, Rey O, Toulza E, Berry A, Boissier J. Schistosomiase émergente en Europe : un besoin de quantifier les risques. Tendances Parasitol. 2017;33:600–9.

Article PubMed Google Scholar

Mori Y, Nagamine K, Tomita N, Notomi T. Détection de la réaction d'amplification isotherme médiée par la boucle par la turbidité dérivée de la formation de pyrophosphate de magnésium. Biochem Biophys Res Commun. 2001;289:150–4.

Article CAS PubMed Google Scholar

Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, et al. Amplification isotherme médiée par boucle d'ADN. Nucleic Acids Res. 2000;28:E63.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Notomi T, Mori Y, Tomita N, Kanda H. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principe, caractéristiques et perspectives d'avenir. J Microbiol. 2015 ; 53 : 1–5.

Article CAS PubMed Google Scholar

Kumar S, Sharma S, Bhardwaj N, Pande V, Savargaonkar D, Anvikar AR. Technique avancée d'amplification isotherme médiée par une boucle lyophilisée (L-LAMP) pour la détection du virus de la dengue. Méthodes Virol J. 2021;293:114168.

Article CAS PubMed Google Scholar

Kumar Y. Méthodes basées sur l'amplification isotherme pour l'évaluation de la sécurité microbiologique et de l'authenticité de la viande et des produits carnés. Contrôle alimentaire. 2021;121:107679.

Article CAS Google Scholar

Buultjens AH, Vandelannoote K, Sharkey LK, Howden BP, Monk IR, Lee JYH, et al. Dispositif open source à faible coût pour la détection par fluorescence haute performance des réactions d'amplification isotherme des acides nucléiques. ACS Biomater Sci Eng. 2021;7:4982–90.

Article CAS PubMed Google Scholar

Velders AH, Ossendrijver M, Keijser BJF, Saggiomo V. T-cup : un dispositif domestique bon marché, rapide et simple pour l'amplification isotherme des acides nucléiques. Glob Chal. 2022;6:2100078.

Article PubMed Google Scholar

Chen Z, Yang T, Yang H, Li T, Nie L, Mou X, et al. Un système de turbidité multicanaux portable pour la détection rapide d'agents pathogènes par amplification isotherme à boucle. J Biomed Nanotechnologie. 2018;14:198–205.

Article CAS PubMed Google Scholar

Matute T, Nuñez I, Rivera M, Reyes J, Blázquez-Sánchez P, Arce A, et al. Réactifs homebrew pour RT-LAMP à faible coût. J Biomol Tech.2021. https://doi.org/10.7171/jbt.21-3203-006.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Detemmerman L, Olivier S, Bours V, Boemer F. PCR innovante sans extraction d'ADN pour le diagnostic de la drépanocytose africaine. Hématologie. 2018;23:181–6.

Article CAS PubMed Google Scholar

Gandasegui J, Fernandez-Soto P, Carranza-Rodriguez C, Perez-Arellano JL, Vicente B, Lopez-Aban J, et al. La méthode LAMPellet à chaleur rapide : une méthode de diagnostic potentielle pour la schistosomiase urogénitale humaine. PLoS Negl Trop Dis. 2015;9:e0003963.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Lee S, Khoo VSL, Medriano CAD, Lee T, Park SY, Bae S. Détection rapide et in situ de bactéries indicatrices fécales dans l'eau à l'aide de méthodes simples d'extraction d'ADN et d'amplification isotherme à médiation par boucle (LAMP) portables. Eau Rés. 2019;160:371–9.

Article CAS PubMed Google Scholar

Davis CN, Tyson F, Cutress D, Davies E, Jones DL, Brophy PM, et al. Détection rapide de Galba truncatula dans les sources d'eau sur les pâturages à l'aide d'une amplification isotherme en boucle pour le contrôle des infections à trématodes. Vecteurs parasites. 2020;13:496.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Williams MR, Stedtfeld RD, Engle C, Salach P, Fakher U, Stedtfeld T, et al. Amplification isotherme de l'ADN environnemental (eDNA) pour la surveillance directe sur le terrain et la confirmation en laboratoire de Dreissena sp. PLoS ONE. 2017;12:e0186462.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Feist SM, Lance RF. Détection génétique des proliférations d'algues nocives d'eau douce : une revue axée sur l'utilisation de l'ADN environnemental (eDNA) chez Microcystis aeruginosa et Prymnesium parvum. Algues nuisibles. 2021;110:102124.

Article CAS PubMed Google Scholar

Comité d'experts de l'Organisation mondiale de la santé sur la lutte contre la schistosomiase. Prévention et lutte contre la schistosomiase et les géohelminthiases : rapport d'un comité d'experts de l'OMS. Genève. 2002. https://apps.who.int/iris/handle/10665/42588. Consulté le 19 avril 2022.

Stensgaard AS, Vounatsou P, Sengupta ME, Utzinger J. Schistosomes, escargots et changement climatique : tendances actuelles et attentes futures. Acta Trop. 2019;190:257–68.

Article PubMed Google Scholar

Soixante-Dixième Assemblée mondiale de la Santé. Réponse mondiale à la lutte antivectorielle : une approche intégrée pour la lutte contre les maladies à transmission vectorielle. Rapport n° : WHA70.16. Genève. 2017. https://apps.who.int/iris/handle/10665/275708. Consulté le 19 avril 2022.

Berry A , Mone H , Iriart X , Mouahid G , Aboo O , Boissier J , et al. Schistosomiase haematobium, Corse. France Emerg Infect Dis. 2014;20:1595–7.

Article PubMed Google Scholar

Zein-Eddine R, Djuikwo-Teukeng FF, Al-Jawhari M, Senghor B, Huyse T, Dreyfuss G. Phylogénie de sept espèces de Bulinus originaires de zones endémiques de trois pays africains, en relation avec la douve du sang humain Schistosoma haematobium. BMC Evol Biol. 2014;14:271.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Chibwana FD, Tumwebaze I, Mahulu A, Sands AF, Albrecht C. Évaluation de la diversité et de la distribution des escargots hôtes intermédiaires potentiels pour la schistosomiase urogénitale : Bulinus spp. (Gastropoda : Planorbidae) du lac Victoria. Vecteurs de parasites. 2020;13:418.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Abe EM, Guo YH, Shen H, Mutsaka-Makuvaza MJ, Habib MR, Xue JB, et al. Phylogéographie de Bulinus truncatus (Audouin, 1827) (Gastropoda : Planorbidae). Troop Med Infect This. 2018;3:1

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Sochorová J, Garcia S, Gálvez F, Symonová R, Kovařík A. Tendances évolutives des locus d'ADN ribosomique animal : introduction à une nouvelle base de données en ligne. Chromosome. 2018;127:141–50.

Article PubMed Google Scholar

Gregory TR, Nicol J, Tamm H, Kullman B, Kullman K, Leitch I, et al. Base de données sur la taille du génome eucaryote. Nucleic Acids Res. 2007;35:D332–8.

Article CAS PubMed Google Scholar

Prokopowich CD, Gregory TR, Crease TJ. La corrélation entre le nombre de copies d'ADNr et la taille du génome chez les eucaryotes. Génome. 2003;46:48–50.

Article CAS PubMed Google Scholar

Iwanaga T, Anzawa K, Mochizuki T. Variations du nombre de copies d'ADN ribosomal dans un génome de Trichophyton interdigitale. Mycoses. 2020;63:1133–40.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Malone JH. Équilibrage du nombre de copies dans l'ADN ribosomal. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112:2635–6.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Johnson SM, Carlson EL, Papagianis D. Détermination du nombre de copies d'ADN ribosomique et comparaison entre les souches de Coccidioides. Mycopathologie. 2015;179:45–51.

Article CAS PubMed Google Scholar

Abbasi I, King CH, Muchiri EM, Hamburger J. Détection de l'ADN de Schistosoma mansoni et de Schistosoma haematobium par amplification isotherme médiée par la boucle : identification des escargots infectés dès la prépatence précoce. Am J Trop Med Hyg. 2010 ;83 : 427–32.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Biompha-LAMP : un nouveau test d'amplification isotherme à boucle rapide pour la détection de Schistosoma mansoni chez l'escargot hôte Biomphalaria glabrata. Troupe de négligence PLoS Dis. 2016;10:e0005225.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Caldeira RL, Jannotti-Passos LK, Jannotti-Passos LK, Dos Santos Carvalho O. Utilisation de méthodes moléculaires pour la détection de masse rapide de Schistosoma mansoni (Platyhelminthes : Trematoda) chez Biomphalaria spp. (Gastropodes : Planorbidés). J Trop Méd. 2017;2017:8628971.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Falzone L, Musso N, Gattuso G, Bongiorno D, Palerme CI, Scalia G, et al. Évaluation de la sensibilité de la PCR numérique des gouttelettes pour la détection du SRAS-CoV-2. Int J Mol Med. 2020;46:957–64.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kojabad AA, Farzanehpour M, Galeh HEG, Dorostkar R, Jafarpour A, Bolandian M, et al. PCR numérique de gouttelettes d'ADN/ARN viral, progrès actuels, défis et perspectives futures. J Med Virol. 2021;93:4182–97.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Catalano S, Léger E, Fall CB, Borlase A, Diop SD, Berger D, et al. Transmission multi-hôte de Schistosoma mansoni au Sénégal, 2015-2018. Urgence Infect Dis. 2020;26:1234–42.

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaneko H, Kawana T, Fukushima E, Suzutani T. Tolérance de l'amplification isotherme médiée par boucle à un milieu de culture et à des substances biologiques. Méthodes J Biochem Biophys. 2007;70:499–501.

Article CAS PubMed Google Scholar

Douchet P, Boissier J, Mulero S, Ferté H, Doberva M, Allienne JF, et al. Rendre visible l'invisible : développement optimisé d'un outil de métabarcoding environnemental de l'ADN pour la caractérisation des communautés parasitaires de trématodes. Environ ADN. 2022;4:627–41.

Article CAS Google Scholar

Rezaei M, Razavi Bazaz S, Morshedi Rad D, Shimoni O, Jin D, Rawlinson W, et al. Une machine portable RT-LAMP/CRISPR pour le dépistage rapide du COVID-19. Biocapteurs (Bâle). 2021;11:369.

Article CAS PubMed Google Scholar

Sreejith KR, Umer M, Dirr L, Bailly B, Guillon P, von Itzstein M, et al. Un appareil portable pour la détection basée sur LAMP du SARS-CoV-2. Micromachines (Bâle). 2021;12:1151.

Article PubMed Google Scholar

Choi G, Guan W. Un analyseur ultracompact d'amplification isotherme médiée par boucle de fluorescence (LAMP) en temps réel. Méthodes Mol Biol. 2022;2393:257–78.

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ajonina C, Buzie C, Möller J, Otterpohl R. La détection d'Entamoeba histolytica et de Toxoplasma gondii dans les eaux usées. J Toxicol Environ Health Part A. 2018;81:1–5.

Article CAS Google Scholar

Télécharger les références

Un merci spécial à Alassane Ndiaye qui a aidé à collecter les échantillons d'ADN environnemental sur le terrain. Nous remercions Celia Robin qui a travaillé sur le projet pendant son stage et a conçu les amorces LOOP supplémentaires.

Cette étude a été financée par l'Agence française de sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail (PNRES 2019/1/059 Molrisk) et la Région Occitanie (programme Schistodiag). Cette étude a été réalisée avec le soutien du LabEx CeMEB, programme ANR "Investissements d'avenir" (ANR-10-LABX-04-01), et dans le cadre des "Laboratoires d'Excellences (LABEX)" TULIP ( ANR-10LABX-41).

Interactions Hôtes Pathogènes Environnement, UMR 5244, CNRS, IFREMER, UM, Université de Perpignan, Via Domitia, 66860, Perpignan, France

Manon Blin, Jérôme Boissier, Stephen Mulero & Olivier Rey

SAS ParaDev®, 66860, Perpignan, France

Manon Blin et Julien Portela

VITROME, Campus International IRD-UCAD, 1386, Dakar, Sénégal

Bruno Senghor

Univ. Grenoble-Alpes, Univ. Savoie Mont Blanc, CNRS-LECA, 38000, Grenoble, France

Stéphane Mulero

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

JP, JB, OR et MB ont conçu l'idée originale et conçu l'étude. MB a réalisé le développement en laboratoire du test Bt-eLAMP. JB, BS et MB ont effectué l'échantillonnage sur le terrain. JB et BS ont fourni une expertise malacologique. SM a fourni la banque eDNA. JB, JP et MB ont analysé et interprété les données. JB et MB ont rédigé le manuscrit. BS, JB, SM, OR, JP et MB ont révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Manon Blin ou Julien Portela.

N'est pas applicable.

N'est pas applicable.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Alignement des amorces Bt-eLAMP sur le marqueur ITS2 (numéro d'accès : MG757890). Chaque flèche représente une amorce. Les nuances vertes représentent la direction de l'hybridation de l'amorce (vert foncé : avant ; vert clair : arrière).

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournir un lien vers la licence Creative Commons et indiquer si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel de tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. La renonciation Creative Commons Public Domain Dedication (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) s'applique aux données mises à disposition dans cet article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit aux données.

Réimpressions et autorisations

Blin, M., Senghor, B., Boissier, J. et al. Développement d'un outil de diagnostic d'amplification isotherme médiée par une boucle environnementale (eLAMP) pour la détection sur le terrain de Bulinus truncatus. Vecteurs parasites 16, 78 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05705-4

Télécharger la citation

Reçu : 24 novembre 2022

Accepté : 15 février 2023

Publié: 28 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1186/s13071-023-05705-4

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt