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Apr 29, 2023

Un écran de plan d'expériences révèle que Clostridium novyi

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 6, Article number: 118 (2023) Citer cet article

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Bien que Clostridium novyi-NT soit une thérapeutique bactérienne anticancéreuse qui germe dans les tumeurs hypoxiques pour tuer les cellules cancéreuses, les véritables déclencheurs de germination de C. novyi-NT sont encore inconnus. Dans cette étude, nous criblons les germinants candidats à l'aide de conceptions expérimentales combinatoires et découvrons par hasard que la D-valine est un germinant puissant, induisant la germination des spores à 50 % à une concentration de 4,2 mM. Une enquête plus approfondie a révélé que cinq analogues de la D-valine sont également germinants et que quatre de ces analogues sont des paires énantiomères. Cet effet stéréoflexible des acides aminés L et D montre que la germination des spores est un processus complexe où les interactions énantiomériques peuvent être des facteurs de confusion. Cette étude identifie également la L-cystéine comme germinant, et l'hypoxanthine et l'inosine comme co-germinants. Plusieurs autres acides aminés favorisent (L-valine, L-histidine, L-thréonine et L-alanine) ou inhibent (L-arginine, L-glycine, L-lysine, L-tryptophane) la germination de manière dépendante de l'interaction. La D-alanine inhibe toute germination, même dans des milieux de croissance complexes. Ce travail jette les bases pour améliorer l'efficacité de la germination des spores de C. novyi-NT dans les tumeurs.

Clostridium novyi Type A est une bactérie sporulée anaérobie obligatoire qui provoque une myonécrose clostridienne, une grosse tête et une hépatite nécrotique chez les ovins, les caprins et les porcs1. Il est notamment responsable de « Dikkop » Swollen Head chez le bélier, une infection qui se produit par des blessures infligées entre de jeunes béliers lors de combats, la mort survenant dans les 48 à 72 h2. C. novyi est plus pathogène chez les bovins que chez l'homme, à l'exception d'une épidémie sporadique d'infections chez des toxicomanes en Ecosse dont l'héroïne avait été contaminée par des spores de C. novyi3.

C. novyi-NT, une version non létale de la bactérie de type sauvage générée par l'atténuation de son alpha-toxine, fait actuellement l'objet d'essais cliniques en tant que thérapeutique expérimentale pour les tumeurs solides4,5. Le potentiel thérapeutique de C. novyi-NT découle de sa capacité à coloniser sélectivement les régions hypoxiques (<0,5 % d'oxygène) des tumeurs et à exercer un effet cytotoxique localisé6. Bien que d'autres clostridies antérieures à C. novyi-NT aient été étudiées pour leur effet tueur de tumeurs, C. novyi-NT a été la première à être administrée sous forme de spores au lieu de bâtonnets végétatifs4. En plus d'être relativement non immunogène, l'administration de C. novyi-NT sous forme de spores ajoute une couche supplémentaire de spécificité tumorale car la germination est favorisée dans le microenvironnement tumoral hypoxique4,6. Les spores, étant dormantes, sont également résistantes à l'oxygène qui autrement les tuerait sous leur forme végétative6. Bien que les spores soient donc la forme clostridienne idéale pour le traitement des tumeurs, on sait peu de choses sur ce qui fait germer une spore de C. novyi-NT, autre que l'exigence d'un environnement réducteur. De plus, ce qui fait de C. novyi-NT un colonisateur efficace pour certaines tumeurs mais pas pour d'autres reste un mystère7.

Nos connaissances actuelles sur les spores bactériennes et la germination reposent en grande partie sur les genres Bacillus et Clostridium8,9. Essentiellement, les bactéries sporulent lorsque les ressources métaboliques sont rares, mais germent lorsque les conditions riches en ressources prévalent à nouveau. La capacité d'attendre patiemment le retour de conditions favorables dans un état dormant résume l'avantage de survie des bactéries sporulantes. Chez les bactéries pathogènes, ce processus cyclique entraîne la pathogenèse, car des spores autrefois bénignes infectent leurs environnements cibles, en germant dans leurs formes végétatives productrices de toxines10,11,12. La germination peut être divisée en deux étapes13. La première étape commence par l'interaction de petites molécules nutritives germinatives avec des protéines spécifiques appelées récepteurs de germination (RG). L'activation des GR provoque la libération de cations monovalents (H+, K+ et Na+) et de dipicolinate de calcium (CaDPA), ainsi que l'hydratation partielle du noyau des spores. Dans la deuxième étape, la couche de cortex des spores est hydrolysée, entraînant une expansion du noyau et une hydratation complète, complétant la transition de la dormance. Par la suite, l'ADN, la synthèse des protéines et les principales voies métaboliques deviennent actives, entraînant la croissance de la forme végétative14.

Les spores bactériennes sont connues pour germer en réponse à un large éventail de facteurs tels que les acides aminés15, les purines16, les sucres17, les sels biliaires18 et les ions19. Les germinants sont des corrélats importants des environnements nutritifs, et les bactéries sporulantes ont donc évolué pour les utiliser comme signaux pour sortir de la dormance des spores. Le dépistage des germes est généralement effectué en détectant la germination des spores, signalée par une baisse de la densité optique ou de la réfringence, en présence de germes candidats uniques. Cependant, les environnements de germination réels sont complexes et contiennent de multiples facteurs qui peuvent potentialiser ou contrarier l'effet de tout germe putatif. Par exemple, les spores de Clostridioides difficile germent en présence du taurocholate, un sel biliaire. Dans l'environnement intestinal, cependant, cette germination peut être contrariée par d'autres sels biliaires secondaires dérivés de microbes tels que le lithocholate et l'ursodésoxycholate20. Dans le scénario opposé, les germes putatifs nécessitant des interactions positives avec d'autres facteurs de l'environnement pourraient donner un faux résultat négatif lorsqu'ils sont évalués comme un seul candidat.

Le criblage des germes candidats un par un donnera toujours une image incomplète si des interactions existent entre eux. Une approche qui filtre les facteurs de germination dans des combinaisons est donc nécessaire car l'intuition traditionnelle de ne changer qu'un seul facteur à la fois devient exponentiellement inefficace à mesure que le nombre de variables augmente. Dans une approche de conception d'expériences (DOE), plusieurs facteurs sont modifiés simultanément de manière structurée21. Dans le domaine de la biologie des spores, le DOE a été utilisé pour optimiser les composants du milieu pour la sporulation bactérienne22,23,24 et la culture25,26,27. Dans cette étude, nous utilisons le DOE pour identifier les facteurs germinatifs ayant les effets les plus significatifs, ainsi que les interactions entre eux. Ces expériences ont révélé des candidats germinants et co-germinants, et ont en outre conduit à l'observation fortuite de la D-valine et de ses analogues en tant que puissants germinants de C. novyi-NT.

Le tableau supplémentaire 1 est un exemple de conception DOE, où les lignes représentent des expériences indépendantes et les colonnes représentent les facteurs testés. Chaque ligne teste une combinaison différente de facteurs testés qui sont soit présents (+) soit absents (-). Chaque colonne a un nombre égal de niveaux + et -, et deux colonnes choisies au hasard et placées de manière adjacente ont un nombre égal de niveaux appariés (++, +−, −+ et −−). Ainsi, chaque niveau (+ ou -) de chaque facteur associe un nombre égal de fois à chaque niveau (+ ou -) de chacun des autres facteurs. Les niveaux + et - de n'importe quel facteur peuvent ainsi être directement comparés les uns aux autres puisque les deux sont soumis exactement au même fond équilibré des autres facteurs. Utilisés de cette manière, les écrans DOE estiment les facteurs les plus significatifs parmi une multitude de facteurs candidats en utilisant un nombre efficace d'essais expérimentaux.

Nous avons caractérisé les exigences de germination de C. novyi-NT de trois manières, en recherchant les germinants primaires, les co-germinants et les interactions entre les candidats identifiés (Fig. 1a). La conception Plackett-Burman (PB) (tableau supplémentaire 1) a été utilisée dans les expériences initiales où le nombre de facteurs à tester était élevé (> 5). Une fois ce nombre filtré sur les pro-germinants clés, un plan factoriel complet (tableau supplémentaire 2) a ensuite été utilisé pour analyser toute interaction entre eux. Dans toutes les expériences, la germination a été mesurée par la baisse de la DO600 au fil du temps. Toutes les lectures positives de germination ont été vérifiées par la perte de réfringence sous microscopie à contraste de phase. Des concentrations non physiologiques élevées ont d'abord été utilisées dans les cribles germinatifs pour minimiser les faux négatifs. Des études dose-réponse ont ensuite été utilisées pour étudier les germes criblés à des concentrations physiologiques. Dans cette étude, tous les candidats germinatifs sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 3, les termes techniques utilisés dans les graphiques DOE sont définis dans le tableau supplémentaire 4 et tous les tests statistiques effectués sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 5.

un schéma de l'approche de conception d'expériences (DOE). b 20 acides aminés L à des concentrations dans le tableau supplémentaire 3 ont été ajoutés dans différentes combinaisons selon la conception de Plackett-Burman (PB) dans le tableau supplémentaire 1. La figure représente les différentes combinaisons triées par ordre décroissant (de haut en bas) de la réponse de germination exprimé en ΔOD (colonne extrême droite) tel que défini dans le tableau supplémentaire 4. La figure montre également l'effet (rangée du bas) de chaque acide aminé L sur le ΔOD, classé par ordre croissant de gauche à droite. Les facteurs surlignés en rouge et vert aux deux extrémités de la matrice représentent les acides aminés L avec les effets antagonistes et pro-germination les plus significatifs respectivement (ɑ = 0,0005). Toutes les données ont été moyennées à partir de deux expériences indépendantes avec deux répétitions chacune et représentent des valeurs de réponse moyennes. c 20 acides aminés L à deux fois les concentrations du tableau supplémentaire 3 ont été ajoutés individuellement par puits. Le diagramme de points de dispersion de l'étendue de la germination pour 20 acides aminés L en tant que facteurs uniques est indiqué (moyenne ± SD), n = 4 échantillons biologiquement indépendants. La ligne pointillée représente le seuil de 10 % pour la germination. Les acides L-aminés sont triés en fonction de leur pourcentage de germination (tel que défini dans le tableau supplémentaire 4), du plus élevé au plus bas de gauche à droite. La zone ombrée en violet met en évidence les acides aminés L qui présentent une germination significative par rapport à la L-valine (test t non apparié, **** p <0,0001). d Diagramme de Venn des candidats pro-germination significatifs découverts à travers l'écran PB (vert) et l'écran à facteur unique (violet).

Les acides L-aminés signalent la présence de nutriments et sont les germes les plus courants pour les spores bactériennes. Nous avons pris les 20 acides aminés L canoniques (tableau supplémentaire 3) et les avons testés pour leurs propriétés germinatives en utilisant deux approches parallèles. Dans le premier, nous avons testé des combinaisons d'acides L-aminés en utilisant une approche DOE spécifique appelée Plackett-Burman (PB)28. Dans le second, nous avons testé chaque acide L-aminé indépendamment comme cela se fait habituellement.

Pourquoi exécuter PB à côté d'un écran germinatif régulier ? Premièrement, un crible PB identifierait non seulement les germes mais aussi les antagonistes de la germination. La deuxième raison est liée aux interactions. Le PB, qui, de par sa conception, est basé sur des combinaisons de facteurs, produira des résultats divergents avec l'écran à un seul facteur s'il existe des interactions entre les facteurs. Il s'agit d'une limitation du PB lorsqu'il est utilisé dans le but principal de dépistage de facteurs indépendants. Ici, nous utilisons intentionnellement cette propriété pour révéler l'existence d'interactions entre les acides aminés L. Après tout, il est concevable que des interactions puissent exister pour rendre un acide L-aminé germinatif plus ou moins puissant en présence d'un autre acide L-aminé. Inversement, s'il n'y avait pas d'interactions, les deux écrans devraient donner des résultats identiques.

Pour l'écran PB, 24 combinaisons des 20 acides aminés L canoniques ont été construites de sorte que chaque acide aminé soit présent dans la moitié des combinaisons et absent dans l'autre moitié (tableau supplémentaire 1). Une conception PB ne nécessite qu'une fraction de toutes les 220 permutations possibles d'acides L-aminés à tester, ce qui permet d'effectuer une seule expérience PB avec des mesures cinétiques OD600 dans une seule plaque de microtitration, chaque puits correspondant à une combinaison. Deux expériences PB (chacune avec deux répétitions par combinaison) ont été réalisées, et le tracé normal des effets standardisés est présenté dans la Fig. S1 supplémentaire. De plus, une représentation plus intuitive des données de la ΔOD pour chaque combinaison et de l'effet associé à chaque acide L-aminé est illustrée à la Fig. 1b. Les colonnes montrent le classement des candidats germinants classés par leur effet associé sur la germination, tandis que les lignes montrent des combinaisons de ces candidats classés classés par réponse de germination. Dans cette étude, nous utilisons le terme « pro-germinant » ou « facteur de pro-germination » pour désigner un facteur qui favorise la germination, qu'il agisse indépendamment (par exemple, en tant que germinatif primaire) ou en combinaison (par exemple, en tant que un co-germinant). Le long des colonnes, quatre facteurs pro-germinatifs (L-valine, L-cystéine, L-histidine et L-thréonine), ainsi que quatre facteurs anti-germinatifs (L-arginine, L-glycine, L-lysine et L- tryptophane), ont été identifiés comme ayant des effets significatifs (99,95 IC, ajustement du modèle R2 = 92,1%). Étant donné que les lignes représentent des combinaisons et que celles-ci sont classées de la même manière par réponse de germination, on pourrait s'attendre s'il n'y avait pas d'interactions, que la ligne contenant chaque germe candidat soit classée au sommet ou près du sommet. Au lieu de cela, nous voyons que la rangée contenant tous les candidats se trouve dans la rangée 11 sur 24. En utilisant cette rangée comme référence visuelle, les facteurs de pro-germination sont enrichis au-dessus de la rangée 11 en haut à droite. A l'inverse, les facteurs antigerminatifs sont enrichis en dessous de la ligne 11 en bas à gauche. Cela correspond à notre intuition selon laquelle la soustraction des facteurs anti-germinants de la ligne 11 devrait augmenter la réponse de germination, et ces combinaisons devraient être classées au-dessus de la ligne 11. D'autre part, la soustraction des facteurs de pro-germination de la ligne 11 aurait l'effet inverse en diminuant la réponse de germination, et ces combinaisons seraient classées sous la ligne 11. Ces résultats montrent que nous manquons d'informations importantes en ne tenant pas compte des interactions. Parallèlement au criblage PB, un criblage à facteur unique a été réalisé avec chacun des 20 acides aminés L évalués indépendamment en tant que candidats germinants (Fig. 1c). Ici, la L-cystéine et la L-alanine ont significativement induit plus de 10 % de germination et ont été identifiées comme germinantes.

Pris ensemble, les résultats du PB et du facteur unique montrent que les interactions modulent effectivement l'activité des facteurs de germination d'une manière qui n'est pas reflétée par un écran de germination à facteur unique typique (Fig. 1d). La L-cystéine était le seul germe identifié dans les deux cribles, montrant que ses capacités de germination étaient efficaces même lorsqu'elles étaient mélangées à d'autres acides aminés. Les germes restants ont été identifiés soit dans le PB, soit dans le crible à facteur unique seul. La L-alanine, par exemple, n'a été identifiée que dans le criblage à facteur unique, ce qui suggère que ses capacités de germination en tant qu'agent unique étaient masquées par des interactions inhibitrices avec d'autres acides aminés. Enfin, la L-valine, la L-histidine et la L-thréonine ont été identifiées comme germinantes dans le crible PB seul. Cela montre que certains acides aminés L, bien qu'inertes par eux-mêmes, peuvent probablement favoriser la germination en présence d'autres facteurs dans l'environnement.

Ensuite, nous avons étudié les interactions entre les 5 acides aminés L (Fig. 1d) identifiés comme ayant un effet positif sur la germination en testant les 25 combinaisons de ces germes pour les interactions entre eux (Fig. 2a et Tableau supplémentaire 2). Semblable à la figure 1b, les colonnes de la figure 2a montrent les pro-germinants classés en fonction de leur effet sur la germination et les lignes montrent des combinaisons de ces pro-germinants classés par réponse de germination. Dans ces résultats, la L-cystéine occupe les rangs supérieurs et est absente des rangs inférieurs. En bref, une réponse de germination élevée n'est obtenue que si la L-cystéine est présente. La dominance de la L-cystéine en tant que pro-germinant par rapport aux autres pro-germinants d'acides aminés L se reflète également dans la visualisation alternative de la figure 2b, qui montre la réponse de germination sous forme de pente au lieu d'une carte thermique. La dominance de la L-cystéine coïncide avec le fait qu'elle est le seul acide aminé identifié à la fois dans le dépistage PB et le dépistage à facteur unique. Cela reflète peut-être que la L-cystéine a un fort effet de germination primaire qui n'est pas facilement antagonisé par les autres acides L-aminés. La L-valine et la L-alanine, en revanche, étaient des finalistes plus faibles (Fig. 2a, b). En creusant plus profondément, nous avons demandé s'il y avait des interactions significatives entre les 5 pro-germinants d'acides aminés L. Les résultats de cette analyse sont présentés sous la forme d'un graphique d'interaction secondaire, qui montre la réponse de germination pour chaque paire d'acides aminés possible, qu'elle soit présente ou absente (Fig. 2c). Chaque graphique en boîte se trouve à l'intersection de deux étiquettes d'acides aminés, l'une le long de la même ligne que la boîte (le "facteur de ligne") et l'autre le long de la même colonne que la boîte (le "facteur de colonne"). Dans chaque encadré, la ligne bleue établit la réponse de germination de base pour le facteur de colonne et la ligne rouge montre la réponse de germination modifiée lorsque le facteur de ligne est présent. S'il n'y a pas d'interactions, le résultat attendu est que les lignes rouges et bleues de chaque graphique en boîte seront approximativement parallèles. Puisqu'il s'agit de l'observation de la figure 2c, la conclusion est qu'il n'y a pas d'interactions fortes entre les 5 pro-germinants d'acides aminés L.

Des expériences factorielles complètes ont été réalisées impliquant les facteurs de pro-germination (panels a–c) et les antagonistes de la germination de la L-cystéine (panels d–f). Les deux conceptions expérimentales sont détaillées dans le tableau supplémentaire 2. Les concentrations utilisées étaient les mêmes que celles de l'écran Plackett-Burman. a, d Les figures représentent les différentes combinaisons de facteurs, triées par ordre décroissant (de haut en bas) de ΔOD (colonne extrême droite) tel que défini dans le tableau supplémentaire 4. L'effet (rangée du bas) de chaque acide aminé L sur ΔOD, disposés par ordre croissant de gauche à droite sont également affichés. b, e Diagramme d'interaction principal des acides aminés L pro-germination (lignes bleues avec cercles, modèle ɑ = 0,0001) et des acides aminés L antagonistes avec la L-cystéine (lignes rouges avec cercles, modèle ɑ = 0,001) montrant respectivement la moyenne de ΔOD pour chaque concentration d'acides aminés. c, f Graphique d'interaction secondaire montrant les interactions entre toutes les paires de facteurs. Les lignes bleues avec des cercles représentent l'absence et les lignes rouges avec des cercles représentent la présence des acides aminés L indiqués. Toutes les données ont été moyennées à partir de deux expériences indépendantes avec deux répétitions chacune et représentent des valeurs de réponse moyennes. Les pentes positives indiquent des effets positifs sur la germination, tandis que les pentes négatives indiquent des effets inhibiteurs.

Étant donné que le criblage PB avait également identifié des acides aminés qui annulaient la germination, nous avons utilisé le même ensemble d'analyses factorielles complètes pour étudier l'effet de ces 4 facteurs négatifs (glycine, L-arginine, L-lysine et L-tryptophane) sur L -germination induite par la cystéine. Dans la carte thermique factorielle complète, on peut voir que la L-cystéine est nécessaire mais insuffisante pour une forte réponse de germination (Fig. 2d). La L-cystéine est présente dans les 4 premières rangées où se produit la seule germination significative. L'effet germinatif de la L-cystéine tombe à zéro lorsque la L-arginine ou la L-glycine sont présentes. La visualisation alternative de la figure 2e confirme cette observation et révèle en outre une interaction plus faible avec la L-lysine. Cette intuition est encore renforcée par le diagramme d'interaction secondaire (Fig. 2f), qui montre des lignes bleues et rouges non parallèles pour plusieurs graphiques en boîtes. Comme prévu, un écart par rapport au parallèle est observé pour les 4 graphiques en boîte liés à la L-cystéine + L-glycine et à la L-cystéine + L-arginine. De plus, il existe également des écarts par rapport au parallèle pour les 2 graphiques en boîte liés à la L-arginine et à la L-glycine. Dans ces deux graphiques, l'absence de L-arginine et de L-glycine est associée à une germination élevée déclenchée par la L-cystéine. La présence, cependant, de L-arginine ou de L-glycine ou des deux, n'entraîne aucune germination. Les analyses factorielles complètes ci-dessus impliquent que les acides aminés inhibiteurs dans l'environnement naturel peuvent agir comme modificateurs antagonistes du fort effet pro-germinant de la L-cystéine. Fait intéressant, le L-tryptophane, qui avait un effet inhibiteur dans le crible PB, a montré un effet très légèrement positif sur la germination. L'effet de certains acides aminés sur la germination peut donc être très contextuel, soulignant la nécessité de sonder l'espace combinatoire des candidats germinants.

Nous avons ensuite testé les dérivés de purine, qui sont la deuxième classe germinative la plus courante pour les spores bactériennes après les acides L-aminés. Les candidats puriques ont été testés en parallèle à l'aide des écrans factoriels complets et à facteur unique, mais aucun n'a déclenché la germination dans l'un ou l'autre des écrans (Figs supplémentaires S2a – S2c). Étant donné que les purines sont connues pour agir comme co-germinants29 et que le nombre de purines testées était faible, nous avons conçu un crible factoriel complet avec toutes les combinaisons possibles de 5 purines. Une concentration sous-optimale de L-cystéine insuffisante pour déclencher une germination complète a été utilisée comme condition de base. Toute activité co-germinante à la L-cystéine serait donc révélée par une baisse accrue de la DO600. Les résultats démontrent sans équivoque que l'hypoxanthine et l'inosine sont toutes deux de puissants co-germinants pour la germination médiée par la L-cystéine, tandis que l'adénosine, la xanthine et la xanthosine inhibent la germination (Fig. 3a, b). Le graphique d'interaction secondaire (Fig. 3c) révèle en outre des lignes non parallèles pour les graphiques entre l'hypoxanthine et l'inosine. Ici, l'hypoxanthine ou l'inosine seule sont suffisantes comme co-germinant pour déclencher une forte germination, et l'étendue de la germination n'est pas améliorée par la présence des deux. Il convient également de noter les graphiques non parallèles moins spectaculaires pour l'hypoxanthine par rapport à l'adénosine et l'hypoxanthine par rapport à la xanthosine. Celles-ci montrent que l'effet pro-germinant de l'hypoxanthine est légèrement antagonisé par l'adénosine et la xanthosine.

La réponse de germination a été mesurée en présence de L-cystéine (10 mM) pour toutes les combinaisons de purines (0, 1 mM) selon le plan factoriel détaillé dans le tableau supplémentaire 2 (panneaux a à c). a La figure montre les différentes combinaisons de purines en présence de L-cystéine germinative principale, triées par ordre décroissant (de haut en bas) de ΔOD (colonne extrême droite) tel que défini dans le tableau supplémentaire 4. La figure montre également l'effet (rangée du bas ) de chaque purine sur ΔOD, classés par ordre croissant de gauche à droite. b Tracé des interactions principales pour les cinq analogues de purine (lignes bleues avec cercles, modèle ɑ = 0,0005). c Graphique d'interaction secondaire montrant les interactions entre toutes les paires de facteurs. Les lignes bleues avec des cercles représentent l'absence et les lignes rouges avec des cercles représentent la présence des purines indiquées. d Structures des cinq analogues de purine. Un anneau de purine réduit comportant une double liaison C2-N3 (flèche verte) est associé à la germination. Toutes les données ont été moyennées à partir de deux expériences indépendantes avec deux répétitions chacune et représentent des valeurs de réponse moyennes.

Pour comprendre si ces effets co-germinants étaient dépendants du contexte, nous avons testé ces mêmes 5 purines seules, c'est-à-dire pas en combinaisons (Fig. S2c supplémentaire). Ici, nous avons constaté que l'hypoxanthine et l'inosine présentaient toujours de forts effets de co-germination, corroborant l'expérience factorielle complète antérieure. De plus, cependant, l'adénosine a également présenté un effet co-germinant significatif, en contraste direct avec son effet inhibiteur dans l'expérience factorielle complète. De tels effets contextuels pour l'adénosine ne sont pas sans précédent. Par exemple, l'adénosine inhibe la germination déclenchée par l'inosine des spores de Bacillus cereus tout en agissant simultanément comme co-germinant avec la L-alanine30. Dans le cas de C. novyi-NT, il semble que l'adénosine puisse agir comme co-germinant puissant en l'absence d'autres purines mais peut-être pas autrement.

En comparant les structures des purines testées avec l'activité de germination, nous observons que l'hypoxanthine, l'inosine et l'adénosine partagent en commun la forme réduite du cycle purine, comportant une double liaison entre N3 et C2, qui peut être importante pour l'activité co-germinante ( figure 3d). La xanthosine et la xanthine partagent quant à elles la forme purine oxydée, avec un carbonyle en C2 qui peut expliquer leur activité inhibitrice. Ces observations sont corrélationnelles et nécessitent d'autres études structure-activité pour établir la causalité.

Les récepteurs de germination sont souvent stéréospécifiques dans leur reconnaissance des germes d'acides aminés L, un stéréoisomère déclenchant la germination et l'autre l'inhibant. Bacillus subtilis est un exemple classique, où la germination induite par la L-alanine est inhibée par la D-alanine31. Nous nous sommes demandé si la germination par la L-cystéine, la L-alanine et la L-valine pouvait être contrariée par leurs partenaires stéréoisomères, donnant éventuellement des indices sur la hiérarchie de la signalisation de la germination.

Pour répondre à cette question, les réponses de germination à ces trois facteurs ont été mesurées en présence ou en l'absence de D-cystéine, D-alanine et D-valine. Tous les germes étaient fortement inhibés par la D-alanine, ce qui montre que ces germes agissaient par des voies de signalisation et non par des stimulus physicochimiques (Fig. 4a, b). La D-cystéine a également montré un effet inhibiteur, mais pour un sous-ensemble de germes (L-cystéine et L-valine). L'effet inhibiteur de la D-alanine était efficace même dans les milieux complexes, démontrant son rôle potentiel en tant qu'interrupteur inhibiteur principal. (Fig. 4c). La D-cystéine, par comparaison, a permis la germination dans des milieux complexes. Dans les cas où la D-alanine inhibe la germination des spores dans d'autres bactéries, elle est souvent présente dans le peptidoglycane des spores ou libérée pendant la germination afin de minimiser la germination prématurée, un phénomène appelé autoinhibition32,33. L'analyse LC-MS a montré que c'était le cas avec C. novyi-NT, avec de la D-alanine présente dans le peptidoglycane des spores dormantes et germées, ainsi que des bactéries végétatives bien qu'elle n'ait pas été activement libérée dans le milieu pendant la germination. (Fig. 4d). Les images des spores utilisées dans l'analyse LC-MS sont présentées dans la Fig. S3 supplémentaire.

un diagramme en points de dispersion du pourcentage de germination (tel que défini dans le tableau supplémentaire 4) par les germes d'acides aminés L (91, 5 mM) en présence d'inhibiteurs d'acides aminés D candidats (91, 5 mM). Les cercles verts, rouges et bleus désignent respectivement la L-cystéine, la L-alanine et la L-valine. Toutes les données représentent la moyenne ± SD, n = 4 échantillons biologiquement indépendants. Signification à ****p ≤ 0,0001 (test t non apparié). b Tableau récapitulatif des résultats de (a). c Images en contraste de phase de spores inoculées pendant la nuit dans un milieu RCM-FBS oxyrase contenant de la D-alanine (93,5 mM), de la D-cystéine (93,5 mM) et de l'eau. Les images sont les mieux représentatives de deux expériences indépendantes. Grossissement 1600×, barre d'échelle 2 µm. d Spectres EIC LC-MS de l'ion alanine dérivé (351 m/z) pour les étalons de L-alanine, de D-alanine et d'échantillons d'extraits de peptidoglycane de spores dormantes, de spores germées, de bactéries végétatives et de surnageants de spores germées dans la L-cystéine , L-alanine, L-valine ou D-valine. Les lignes pointillées représentent les pics standard pour la L-alanine et la D-alanine à des temps de rétention de 13,4 et 14,05 min, respectivement. Les données présentées sont le meilleur représentant des spectres soustraits à blanc d'eau de deux expériences indépendantes.

Le candidat inhibiteur final, la D-valine, n'a inhibé aucun des germes, et bien au contraire, a même semblé s'ajouter à la germination de base induite par la L-valine (Fig. 4a).

Intrigués par les résultats de la D-valine, nous avons effectué un crible de germination à facteur unique sur un panel de 19 acides aminés D. À notre grande surprise, la D-valine pouvait en effet déclencher la germination des spores de C. novyi-NT et était le seul acide aminé D capable de le faire (Fig. 5a). Les spores germées de D-valine sont apparues en phase sombre sous microscopie à contraste de phase, confirmant ainsi ce résultat initial (Fig. 5b).

un écran à facteur unique pour 19 acides aminés D où chaque acide aminé D a été testé individuellement pour la germination aux concentrations du tableau supplémentaire 3. La ligne pointillée représente un seuil de germination de 10 %. Les acides aminés D sont triés par ordre décroissant de % de germination de gauche à droite. Significatif à ****p ≤ 0,0001 (test t non apparié) par rapport à la D-thréonine. b Image en contraste de phase des spores de C. novyi-NT germées avec la D-valine (45, 7 mM) à un grossissement de 1000 ×. Barre d'échelle 5 µm. c Courbe dose-réponse pour la réponse de germination à différentes concentrations de D-valine (noir), L-cystéine (vert), L-alanine (rouge) et L-valine (bleu) normalisée à la germination avec D-valine à la concentration la plus élevée 91,5 mM. Les cercles représentent des valeurs individuelles. Les lignes pleines représentent la courbe de régression des moindres carrés. La zone ombrée montre les bandes d'erreur de confiance à 95 % pour chaque ajustement d'acide L-aminé. Les valeurs EC50 sont indiquées dans la légende et sont significatives à ****p ≤ 0,0001,***p ≤ 0,001,**p ≤ 0,01 (test t non apparié) par rapport à la D-valine. d Germination par la D-valine (91,5 mM) en présence d'autres acides aminés D et L (91,5 mM). Significatif à ****p ≤ 0,0001 (test t non apparié) par rapport au contrôle DIW. e Spectres EIC LC-MS de l'ion valine dérivé (379 m/z) pour les étalons de L-valine, D-valine et les échantillons d'extraits de peptidoglycane de spores dormantes, de spores germées, de bactéries végétatives et de surnageants de spores germées dans la L-cystéine , L-alanine, L-valine ou D-valine. Les données présentées sont le meilleur représentant des spectres soustraits à blanc d'eau de deux expériences indépendantes. Les lignes pointillées représentent les pics standard pour la L-valine (20,34 min) et la D-valine (20,73 min) respectivement. Toutes les données de germination représentent la moyenne ± SD, n = 4 échantillons biologiquement indépendants. Le % de germination pour tous les graphiques est défini dans le tableau supplémentaire 4.

La cinétique de la germination de la D-valine, mesurée par la libération de la DO et de l'acide dipicolinique (DPA), était similaire à celle de la L-cystéine et de la L-alanine (Fig. S4 supplémentaire). Il s'avère également que des concentrations significativement plus faibles de D-valine étaient nécessaires pour déclencher la germination par rapport à la L-cystéine ou à la L-alanine, ce qui montre que la D-valine était plus puissante en tant que germination (Fig. 5c). Tout comme la L-cystéine et la L-valine, la germination de la D-valine pourrait être inhibée à la fois par la D-cystéine et la D-alanine, fournissant une preuve supplémentaire que la D-valine est une germination authentique (Fig. 5d).

L'observation selon laquelle la D-valine peut déclencher indépendamment la germination de C. novyi-NT va à l'encontre de l'intuition générale selon laquelle les acides L-aminés favorisent la germination tandis que les acides D-aminés l'inhibent. Il n'a pas été démontré auparavant que la D-valine joue un rôle actif dans la germination des spores bactériennes. La D-valine pourrait-elle jouer un rôle de molécule de signalisation et si oui, quelle était la source de cette D-valine ? Étant donné que la plupart des bactéries incorporent des acides aminés D (principalement de la D-alanine, de la D-glutamine et parfois de la D-valine) dans leur peptidoglycane pendant la phase stationnaire34, nous nous sommes demandé si la D-valine pouvait être un composant de la couche de peptidoglycane du cortex des spores34,35 ,36,37. Pour répondre à cette question, la couche de peptidoglycane de spores dormantes, de spores germées et de bactéries végétatives a été extraite, hydrolysée et analysée à l'aide de la dérivatisation LC-MS (Fig. 5e et Fig. S3 supplémentaire). Cette analyse a révélé que la D-valine n'était pas présente dans le peptidoglycane des spores ou des formes végétatives, même si la L-valine était présente dans les deux (Fig. 5e). De plus, la D-valine était absente du surnageant des échantillons de spores germées de L-cystéine ou de L-alanine ou de L-valine (Fig. 5e et Fig. S3 supplémentaire), montrant que la D-valine n'était ni un constituant du peptidoglycane de la spore, ni libéré pendant la germination. Il est concevable qu'il puisse y avoir une racémase spécifique de la D-valine dans les spores de C. novyi-NT qui génère de la L-valine. Cependant, la L-valine n'a pas été détectée dans les spores germées avec la D-valine, ce qui rend cela peu probable (Fig. 5e).

Puisqu'il a été démontré que la spore n'était pas une source de D-valine et compte tenu de la rareté présumée de la D-valine dans les tissus de mammifères colonisés par C. novyi-NT, nous avons demandé si un analogue de la D-valine pouvait être le germinatif pertinent. . Nous avons criblé une collection d'analogues de la D-valine (Fig. S5 supplémentaire) et découvert 5 analogues présentant une activité germinative (Fig. 6a). Fait intéressant, 4 de ces analogues comprenaient deux paires de stéréoisomères ; L-norvaline et D-norvaline, ainsi que l'acide L-2-aminobutyrique (L-AABA) et l'acide D-2-aminobutyrique (D-AABA). Ces deux paires reflètent notre observation avec la valine, les énantiomères L et D montrant une activité germinative. Puisqu'il avait été précédemment démontré que la D-alanine et la D-cystéine inhibaient la germination par la L- et la D-valine, nous avons réalisé la même expérience et observé que la D-alanine et la D-cystéine étaient également capables d'inhiber la germination induite par les analogues de la valine ( figure 6b). Cela suggère que ces analogues agissent par la même voie de signalisation que la L- et la D-valine, agissant éventuellement par le même récepteur germinatif. Le L-AABA et la D-norvaline, les germes les plus puissants parmi les analogues, ont une puissance similaire à la L-cystéine (Fig. 6c).

a Sélection à facteur unique d'analogues structuraux stéréoisomères de la D-valine. Tous les analogues étaient à une concentration de 91,5 mM. La D-valine et la L-valine ont été utilisées comme contrôles positifs de référence (gris). Tous les analogues de valine avec une germination> 10% (vert) ont été identifiés comme germinants. Significatif à ****p ≤ 0,0001,***p ≤ 0,001,**p ≤ 0,01,*p ≤ 0,05, ns p > 0,05 (test t non apparié) par rapport à l'acide 4-aminobutyrique. b Réponse de germination des analogues de la valine (91,5 mM) Acide L-2-aminobutyrique (cercles oranges), Acide D-2-aminobutyrique (cercles roses), L-norvaline (cercles vert foncé), D-norvaline (cercles violets), S Acide -(3)-aminobutyrique (cercles gris) en présence des inhibiteurs D-cystéine et D-alanine (concentration 91,5 mM). Significatif à ****p ≤ 0,0001,***p ≤ 0,001,**p ≤ 0,01,*p ≤ 0,05, ns p > 0,05 (test t non apparié) par rapport aux contrôles correspondants de l'eau. c La courbe dose-réponse pour la réponse de germination à différentes concentrations d'acide L-2-aminobutyrique (orange), de D-norvaline (violet) et de L-cystéine (vert) (normalisée à la germination avec la D-valine à la concentration la plus élevée de 91,5 mM) montre puissance des analogues de la valine similaires à la L-cystéine. Les cercles représentent des valeurs individuelles. Les lignes pleines représentent la courbe de régression des moindres carrés. La zone ombrée montre les bandes d'erreur de confiance à 95 % pour chaque ajustement d'acide aminé. Les valeurs EC50 sont indiquées dans la légende. d Cadre de signalisation à deux composants proposé pour la germination de C. novyi-NT. Toutes les données de germination représentent la moyenne ± SD, n = 4 échantillons biologiquement indépendants. Le % de germination pour tous les graphiques est défini dans le tableau supplémentaire 4.

Nous nous sommes demandé si peut-être la valine, l'AABA et la norvaline étaient des métabolites dans le C. novyi-NT végétatif. Les métabolites des formes de bâtonnets germés pourraient théoriquement servir de germinants pour stimuler davantage la germination des spores. L'analyse LC-MS pour la valine et la norvaline a été effectuée sur des bâtonnets cultivés en milieu liquide et a montré que les deux étaient absents du C. novyi-NT végétatif en granulés et des milieux conditionnés par sa croissance (Fig. S6a supplémentaire). Pour des raisons techniques, la même analyse LC-MS pour AABA a été réalisée sur des colonies cultivées sur milieu gélosé. Ici, il a été observé que le L-AABA était présent dans les bâtonnets de C. novyi-NT, mais que le D-AABA était absent (Fig. S6b supplémentaire). En plus d'être un métabolite putatif de C. novyi-NT, le L-AABA est également un marqueur non spécifique du sepsis38, ainsi qu'un métabolite produit par d'autres clostridies nécrosantes similaires telles que C. botulinum et C. sordelli39,40, donc aussi impliquant l'environnement comme source potentielle de L-AABA. Ces découvertes suggèrent que les acides aminés D et leurs analogues pourraient jouer des rôles encore inconnus dans la germination des spores bactériennes.

Le DOE a joué un rôle important dans cette étude. Seules la L-cystéine et la L-alanine auraient été identifiées comme germinantes dans un dépistage à facteur unique. La combinaison du DOE avec des cribles à facteur unique a conduit à la découverte de pro-germinants et d'inhibiteurs qui n'agissent qu'en combinaisons, et a conduit à la séquence d'enquêtes qui ont identifié la D-valine et ses analogues comme des pro-germinants authentiques. Les effets de facteurs individuels agissant indépendamment peuvent s'écarter des effets de facteurs combinés, et nous espérons donc que cet outil trouvera une utilisation plus courante dans les études de germination des spores bactériennes. En particulier, de telles interactions entre facteurs existeraient dans le monde réel habité par la spore et le DOE représente un moyen efficace de sonder et de comprendre plus efficacement l'espace combinatoire.

Dans cette première utilisation du DOE dans un crible pour les germinations de spores bactériennes, nous avons identifié les principaux effets de germination pour C. novyi-NT. Bien qu'une voie complète ne puisse pas encore être complètement décrite, il existe suffisamment d'informations pour déduire un cadre rudimentaire pour la séquence des événements de signalisation de la germination (Fig. 6d). Ce cadre purement hypothétique est basé sur le tableau récapitulatif des facteurs de la Fig. 6d, et devra être révisé au fur et à mesure que des données expérimentales seront disponibles. Dans ce cadre, il existe deux éléments fictifs A et B, qui agrègent les signaux des germes et des inhibiteurs. Ici, B est en aval de A et la germination est en aval de B. Puisque la D-alanine inhibe tous les germes, elle est plus susceptible d'agir sur B, qui est l'élément le plus en aval. L'inhibition de la D-cystéine, en revanche, n'est pas absolue, et nous proposons donc qu'elle pourrait agir en amont sur l'élément A. En utilisant un raisonnement similaire, les germes inhibés par la D-cystéine (L-cystéine ; L/D-valine et leurs analogues) agirait également sur le même élément A. Enfin, puisque la L-alanine échappe à l'inhibition de la D-cystéine mais pas de la D-alanine, elle peut agir sur l'élément B en aval.

A et B sont des espaces réservés pour les participants à la signalisation germinative qui n'ont pas encore été identifiés. Les deux pourraient représenter des participants de signalisation uniques ou multiples, et ces participants pourraient éventuellement dériver de deux ensembles d'opérons de germination (NT01CX_0189-0191 et NT01CX_0562-564) dans le génome de C. novyi-NT41. En particulier, NT01CX_0191, NT01CX_0562 et NT01CX_0564 présentent des similitudes de séquence élevées avec les gènes de la famille des récepteurs germinants chez B. cereus et C. botulinum (tableau supplémentaire 6) et sont donc des candidats intéressants pour de futures recherches.

Parmi toutes les classes germinatives, seuls les acides aminés L sont universellement présents dans toutes les spores bactériennes connues en tant que facteurs pro-germinants. La reconnaissance des germinants d'acides aminés est facilitée par les récepteurs de type Ger, qui sont présents dans presque tous les Clostridium et Bacillus sporulants42. Une rare exception à cette règle est C. difficile, qui utilise le récepteur de type Csp (CspA)43,44. Sans surprise, toutes les études de germination impliquant Clostridium ont ainsi identifié au moins un acide aminé comme pro-germinant (c'est-à-dire soit germinant soit co-germinant)45. Comment les facteurs pro-germinants d'acides aminés de C. novyi-NT se comparent-ils à ceux d'autres clostridies ? Dans une enquête sur 14 clostridies (y compris C. novyi-NT de cette étude), la L-alanine (10/14) était le pro-germinant le plus courant, suivi de la L-cystéine (7/14) (tableau supplémentaire 7). C. novyi-NT suit cette tendance populaire en utilisant ces deux acides aminés L comme pro-germinants. En plus de ces deux acides aminés L, les clostridies présentent également d'autres acides aminés L en tant que facteurs pro-germinants à une fréquence plus faible. C. novyi-NT n'est pas différent et présente une réponse de germination à la L-valine. C. novyi-NT germe également en réponse à des germes non canoniques qui ne sont pas des acides aminés L classiques, tels que la L-norvaline et l'acide L-2-aminobutyrique. En ce sens, ils sont similaires à C. frigidicarnis qui répond à la L-norvaline46, et à C. difficile qui répond à la fois à la L-norvaline et à l'acide L-2-aminobutyrique47. L'acide L-2-aminobutyrique peut avoir une importance métabolique en tant que germe nutritif puisqu'il est produit en tant que métabolite intracellulaire dans le C. novyi-NT végétatif. Une possibilité est que la germination de l'acide L-2-aminobutyrique agit comme une rétroaction positive des spores à germination précoce pour encourager une germination supplémentaire. De plus, la similitude structurelle de l'acide L-2-aminobutyrique avec la L-norvaline et la L-valine signifie que les trois pourraient se lier au même récepteur de germination (Fig. S5 supplémentaire). Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour éclaircir ces hypothèses.

À ce jour, pratiquement tous les pro-germinants d'acides aminés signalés pour les clostridies sont des acides aminés L. Les seules clostridies à s'écarter de cette tendance sont C. bifermentans (qui utilise la D-alanine, la D-arginine et la D-sérine comme co-germinants)48,49, C. difficile (qui utilise la D-alanine ou la D-sérine comme a co-germinants)50, et avec cette étude, C. novyi-NT (qui germe en réponse à la D-valine et ses analogues). Étant donné que C. bifermentans, C. difficile et C. novyi-NT sont les seules clostridies à notre connaissance où les panels d'acides aminés D ont été criblés pour l'activité pro-germinante, l'incidence réelle des germinations d'acides aminés D parmi les clostridies est très probablement sous-estimé.

Il est courant que les acides aminés D puissent agir comme inhibiteurs de germination, car les germes d'acides aminés L individuels sont généralement antagonisés par leurs images miroir d'acides aminés D. Nous avons donc été surpris de constater que non seulement la D-valine n'a pas réussi à s'opposer à la germination de la L-valine, mais que la D-valine s'est avérée être un germinatif encore plus puissant que la L-valine. Une autre observation inattendue était que la D-alanine empêchait les spores de germer dans le milieu clostridien renforcé, un milieu de culture riche en complexe. Empiriquement, les acides aminés D peuvent inhiber une gamme plus large de germinations que leurs homologues acides L-aminés. En prenant C. sporogenes comme exemple, il a été démontré que la D-sérine inhibe la germination de la L-sérine et, en outre, de la L-cystéine, de la L-méthionine et de la L-phénylalanine51. La D-alanine, qui s'est également avérée inhiber la germination chez Bacillus thiaminolyticus en L-glutamine, L-norvaline, L-sérine, L-méthionine et L-thréonine, n'est pas différente52. Malgré ces exemples, aucune étude antérieure n'a montré l'inhibition apparemment absolue de la germination telle qu'observée avec la D-alanine dans cette étude. Une possibilité pourrait être le manque d'études testant l'inhibition de la D-alanine dans des milieux complexes riches. Une autre explication est que la signalisation de la germination chez C. novyi-NT peut converger vers un seul portier alors que la nature de la signalisation germinative peut être plus parallèle dans d'autres clostridies, avec plusieurs chemins redondants pour déclencher la germination.

Si les spécificités de la germination de C. novyi-NT restent à préciser, deux grands thèmes sont mis en lumière par ce travail. Premièrement, les facteurs de germination peuvent agir soit avec un haut degré d'indépendance (comme la L-cystéine et la D-alanine), soit de manière interdépendante (comme la L-alanine ou la L-thréonine). Alors que nous nous sommes habitués à considérer les germes de spores comme des acteurs isolés, nos données démontrent que les propriétés germinatives de certains acides aminés peuvent apparaître ou disparaître en fonction de la présence d'autres acides aminés. L'écran PB de notre étude peut montrer l'existence d'interactions, mais il n'est pas conçu pour explorer ces interactions en détail. Plus de travail doit donc être fait pour élucider la nature de ces interactions.

La stéréoflexibilité est le deuxième thème. La nature est pointilleuse sur la chiralité et, par conséquent, les récepteurs de germination des spores reconnaissent généralement des acides aminés L spécifiques comme leurs germes apparentés. Les énantiomères d'acides aminés D de ces germes peuvent en revanche interrompre ces interactions, inhibant ainsi la germination51. Ce modèle homochiral simple et élégant devra peut-être être revisité à la lumière de nouvelles recherches montrant que la D-sérine et la D-alanine peuvent agir comme co-germinants pour C. difficile50,53. Dans cette recherche, l'inactivation génétique d'alr2, une alanine racémase, a abrogé l'activité co-germinante de ces acides aminés D, montrant que la conversion en forme L était essentielle pour l'activité germinative. Bien qu'une activité racémase impliquant la conversion de l'activité racémase D-valine en L-valine puisse théoriquement expliquer la stéréoflexibilité de C. novyi-NT, une telle activité racémase n'a pas été détectée dans cette étude. En variante, il est également possible qu'il existe un récepteur germinatif dans C. novyi-NT qui se lie aux acides aminés de manière stéréoflexible. Il y a certainement un besoin de plus d'investigation pour lever l'ambiguïté entre ces explications possibles. Contrairement à C. difficile, la D-valine et ses analogues n'agissent pas comme des co-germinants mais comme des germinants primaires dans C. novyi-NT, avec des effets de germination rivalisant avec la L-cystéine, le principal acide aminé L germinant. Ces données posent des preuves encore plus solides que le modèle homochiral est incomplet.

En raisonnant à partir de principes premiers, le vocabulaire germinatif d'une bactérie sporulée détermine la niche qu'elle habite. Par conséquent, il est raisonnable de s'attendre à ce que la détection de la germination ne soit pas basée sur quelques nutriments clés, mais sur une détection multiplexée de l'environnement. Les interactions complexes et la détection stéréoflexible peuvent être les clés qui ouvrent la porte au véritable vocabulaire germinatif des spores bactériennes. Ils peuvent également jeter les bases de la compréhension et de l'amélioration de la capacité de colonisation tumorale de C. novyi-NT.

Les tumeurs solides sont peu vascularisées et contiennent des zones d'hypoxie et de nécrose54. Cette propriété est corrélée à de moins bons résultats pour la radiothérapie et la chimiothérapie, mais présente également une opportunité thérapeutique pour les spores de clostridies strictement anaérobies de coloniser et de tuer les cellules cancéreuses55. Toutes les clostridies ne sont cependant pas créées égales à cette fin. Bien que tous soient des anaérobies obligatoires, seules deux des huit souches testées (C. novyi-NT et C. sordelli) se sont avérées dans une étude coloniser efficacement les régions hypoxiques des tumeurs expérimentales4.

Un facteur qui pourrait influencer l'efficacité de la colonisation est la mesure dans laquelle les germes clés sont présents dans le microenvironnement tumoral. Plusieurs facteurs de pro-germination de C. novyi-NT sont à cet égard bien enrichis dans les tumeurs solides. Il a par exemple été démontré que la L-cystéine intratumorale atteint jusqu'à 1,40 mM dans certaines tumeurs56, dépassant la ligne de base moyenne d'environ 0,2 mM dans le plasma57. On pense que des niveaux accrus de cystéine intratumorale protègent les cellules cancéreuses des effets de la radiothérapie58 et de la chimiothérapie59, mais ils peuvent également potentiellement favoriser la germination de C. novyi-NT dans ces niches résistantes au traitement. En fait, C. novyi-NT ne nécessite que 1 mM de L-cystéine en combinaison avec l'un ou l'autre co-germinant (hypoxanthine ou inosine) pour obtenir une germination faible (Fig. S2d supplémentaire).

Outre la L-cystéine, les co-germinants, l'hypoxanthine et l'inosine, sont également enrichis dans les tumeurs60,61. Les deux sont des substrats dans les voies métaboliques des purines qui entraînent la prolifération des cellules cancéreuses et sont libérés des cellules mourantes dans les tissus nécrotiques et en putréfaction. L'hypoxanthine n'est jusqu'à présent pas connue pour favoriser la germination des spores bactériennes. L'inosine est, en revanche, associée à d'autres bactéries colonisant les tissus soit en germinant (B. cereus29, Bacillus anthracis62), soit en co-germinant (Clostridium botulinum type E63). Prises ensemble, les concentrations tumorales de L-cystéine, d'hypoxanthine et d'inosine sont susceptibles d'avoir un effet important sur la colonisation et pourraient contribuer à la variation de germination observée entre différents patients cancéreux traités avec des spores de C. novyi-NT64.

Maintenant que nous avons une image plus complète de la façon dont les spores de C. novyi-NT germent, nous pouvons potentiellement induire la germination de spores dans des tumeurs auparavant non réactives, obtenant ainsi des résultats plus cohérents sur différentes tumeurs solides. En outre, l'ingénierie de souches de C. novyi-NT qui sont plus sensibles à un ou plusieurs de ses germes peut encore augmenter l'effet thérapeutique de cette thérapeutique anticancéreuse prometteuse.

Tous les acides aminés L, acides aminés D (sauf D-histidine), purines, analogues de la valine, chlorure de terbium (212903), maltose (M5895), phosphate de sodium dibasique (S7907), o-phtaldialdéhyde (P0657), N-acétyle la cystéine (A7250), le tétraborate de sodium décahydraté (B3545), le méthanol de qualité HPLC (34860), le 1-propanol (34871), l'acide trifluoroacétique (302031) et l'enzyme mutanolysine (M9901) ont été achetés chez Sigma. Le 2-propanol (29113-95) a été obtenu auprès de Nacalai Tesque. La D-histidine (sc-255057) a été achetée auprès de SantaCruz Biotechnology. L'acétonitrile (1.00317) et le HCl (1.00029) ont été achetés chez Merck. Percoll (17089109) a été acheté auprès de GE Healthcare. L'oxyrase pour bouillon a été achetée auprès d'Oxyrase Inc et Sigma (SAE0013). La peptone de polypeptone BBL (211910), le milieu de viande cuite déshydratée (226730), le bouillon d'infusion cœur-cervelle (BHI, 237500) et le milieu clostridien renforcé (RCM, 218081) ont été achetés auprès de BD. Le sérum bovin fœtal (S1810) a été obtenu auprès d'iDNA Biotechnology.

C. novyi-NT était un don du laboratoire Kinzler-Vogelstein de l'Université John Hopkins, aux États-Unis.

Les spores de Clostridium novyi-NT ont été préparées en utilisant le protocole de Cheong et al.5. Brièvement, 200 µl de 5 × 109 UFC/ml de spores de C. novyi-NT ont été inoculés dans 1 l de milieu de sporulation riche en polypeptone et viande cuite (L-cystéine 0,5 g/l, Phosphate de sodium dibasique ou Na2HPO4 5 g/l, BBL polypeptone peptone 30 g/l, milieu de viande cuite déshydratée 50 g/l, maltose 10 g/l et FBS 10 % v/v) et la culture a été sporulée dans un bocal anaérobie BD GasPakTM scellé et incubée à 37 °C pendant trois semaines. Les spores ont été récoltées en remettant en suspension le culot dans du PBS 1X et en séparant les spores des cellules végétatives en utilisant une solution de Percoll à 90 % à 15 000 rcf pendant 30 min dans une centrifugeuse haute performance Beckman Avanti J-20 XP. La qualité des spores a été vérifiée par microscopie à contraste de phase et s'est avérée contenir > 99 % de spores brillantes en phase. La concentration de spores a été ajustée à 5 × 109 UFC / ml par dilution appropriée dans du PBS 1 × en utilisant une courbe standard corrélant l'absorbance DO600 au nombre de cellules.

Toutes les expériences de germination des spores ont été réalisées en anaérobiose en utilisant de l'oxyrase pour l'enzyme de bouillon dans une plaque à micropuits transparente Greiner Bio-One 384 (#781186). Les conditions anaérobies en elles-mêmes n'ont déclenché aucune germination. À 50 µl de solution germinante contenant de l'oxyrase (1:50 v/v) et des germinants dans différentes combinaisons comme décrit ci-dessous, 3,5 µl de 5 × 109 UFC/ml de spores de C. novyi-NT dans du PBS 1 × ont été ajoutés. La plaque a été rendue étanche à l'air avec un film d'étanchéité Sealplate et incubée à 37°C pendant une nuit. La lecture OD600 a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques multimode Tecan Spark® toutes les 10 minutes via le logiciel Spark Control Dashboard V2.2.

Toutes les réponses de germination au point final ont été calculées approximativement au temps t = 7,3 h. Toutes les analyses de conception de dépistage DOE ont été effectuées à l'aide de Minitab 20. Les paramètres d'ajustement du modèle pour toutes les expériences DOE sont présentés dans le tableau supplémentaire 8. La réponse de germination pour toutes les expériences DOE et les expériences de germination basées sur un facteur unique ont été calculées comme spécifié dans le tableau supplémentaire. 4.

Le plan Plackett-Burman est un plan de criblage factoriel fractionnaire à deux niveaux qui utilise des concentrations élevées et faibles pour étudier les variables N-1 à l'aide de combinaisons N, où N est un multiple de 4. Pour les 20 acides aminés L, une combinaison de 24 La conception Plackett-Burman utilisant Minitab19 a été générée comme indiqué dans le tableau supplémentaire 1 et a été installée dans une plaque de microtitration à 384 puits à l'aide du poste de travail automatisé Biomek i5, où chaque puits consistait en une combinaison particulière de tous les 20 acides aminés L préparés à partir de un mastermix selon chaque ligne du tableau supplémentaire 1. Tous les 20 acides aminés L ont été préparés à des concentrations de stock élevées, qui, une fois diluées par un facteur de 20 et mélangées avec les spores, ont donné des concentrations finales (niveau élevé) décrites dans le tableau supplémentaire 3. La concentration de bas niveau a été fixée à zéro.

Pour le criblage à facteur unique d'acide L-aminé, chaque puits ne contenait qu'un seul acide aminé et les concentrations finales étaient le double de celles du test PB (tableau supplémentaire 3). Le criblage à facteur unique d'acide D-aminé a également été effectué de manière similaire, mais en utilisant les concentrations finales lorsqu'elles sont mélangées avec des spores, comme indiqué dans le tableau supplémentaire 3. Pour les analogues de D-valine, la concentration finale lorsqu'elle est mélangée avec des spores était de 91, 5 mM. La concentration finale de purines lorsqu'elles sont mélangées avec des spores dans les cribles à facteur unique co-germinants était de 0,1 mM, tandis que les niveaux finaux de L-cystéine ajoutés à chaque puits lorsqu'ils étaient mélangés avec des spores étaient de 10 mM. Pour l'expérience de germination au niveau physiologique, des purines et de la L-cystéine ont été utilisées à des concentrations finales de 0,1 et 1 mM respectivement.

Une conception factorielle complète telle que décrite dans le tableau supplémentaire 2 a été utilisée pour étudier la réponse de germination avec des purines et pour l'étude d'interaction des acides L-aminés. Pour l'écran germinatif combinatoire et l'écran co-germinant combinatoire avec des purines, des solutions mères de 0,6 mM de purines respectives dans du NaOH 0,005 N ont été préparées et diluées (concentration finale 0,1 mM) en l'absence et en présence de L-cystéine (concentration finale 10 mM) respectivement avec chaque puits représentant une combinaison du plan factoriel. Pour les études d'interaction des acides L-aminés, la L-cystéine et les résultats positifs du crible PB et à facteur unique et les résultats négatifs du crible PB ont été utilisés respectivement. Les concentrations utilisées étaient les mêmes que dans le tableau supplémentaire 3. Tous les tests ont été configurés sur une plaque de microtitration à 384 puits à l'aide du poste de travail automatisé Biomek i5.

Pour les études d'inhibition de la germination, des volumes égaux du germinant avec l'inhibiteur énantiomère ont été ajoutés de sorte que les concentrations finales des deux lorsqu'ils sont mélangés avec des spores étaient de 91,5 mM chacune. Pour les expériences dose-réponse, des solutions mères de germes à 100 mM ont été diluées en série deux fois dans de l'eau déminéralisée jusqu'à une concentration de 90 µM. Les concentrations finales lorsqu'elles étaient mélangées avec des spores allaient de 91,5 mM à 89 µM.

Pour le test de libération du dipicolinate, tous les germes ont été préparés à une concentration de 200 mM et dilués à une concentration finale de 100 mM dans un mélange contenant du chlorure de terbium 0,1 mM et de l'oxyrase (1:50 v/v). A 50 pl de cette solution, 3,5 pl de spores de C. novyi-NT ont été ajoutés dans une plaque de microtitration Greiner Bio-One 384 UV star. Les concentrations finales après addition des spores étaient de 93,5 mM pour les germinations et de 0,09 mM pour le terbium. La lecture OD600 et la fluorescence à 545 nm (temps de latence de 20 µs) ont été mesurées à l'aide d'un lecteur de microplaques multimode Tecan Spark® toutes les 10 min via le logiciel Spark Control Dashboard V2.2.

Au milieu RCM-FBS contenant de l'oxyrase (1:50 v/v), l'acide aminé D correspondant ou de l'eau ont été ajoutés, suivis de l'ajout de spores de C. novyi-NT dans des tubes Eppendorf de 1,5 ml. Les concentrations finales des composants étaient 93,5 mM d'acides aminés D, 0,35 x RCM, 9,3 % de FBS. Les tubes de culture ont ensuite été incubés pendant une nuit à 37 ° C et des aliquotes de la culture pendant la nuit ont ensuite été imagées.

Des aliquotes (10 µl) d'expériences de germination/excroissance pendant la nuit ont été ajoutées à une lame de microscope Superfrost plus, recouvertes de lamelles de microscope n° 1,5, puis scellées avec du vernis à ongles. Les lames ont ensuite été imagées sur un microscope Zeiss inversé Axio Observer 7 à l'aide d'un objectif APOCHROMAT Plan Ph3 100 × / 1,4 réglé à un réglage Optovar de grossissement 1 × ou 1,6 × comme spécifié. Les images ont été capturées à l'aide d'une caméra Hamamatsu CMOS et du logiciel Metamorph (Molecular devices, 7.10.3) avec un temps d'exposition de 100 ms en mode contraste de phase. Les images ont été recadrées à l'aide d'ImageJ Version 1.53n.

Les protocoles d'extraction du peptidoglycane ont été adaptés de Atrih et al. (1996, 1998) et Popham et al. (1996) pour les spores et Atrih et al. (1999) pour les bactéries végétatives.

En bref, 3 ml de spores de C. novyi-NT (5 × 109 UFC/ml) ont été mis à germer à 37 °C pendant 30 min dans une solution germinative contenant de la L-cystéine (100 mM), de l'hypoxanthine (0,1 mM) et de l'oxyrase (1 : 50 v/v) qui, lorsqu'il est dilué avec des spores, donne une concentration finale de L-cystéine (82 mM) et d'hypoxanthine (0,08 mM). Des quantités équivalentes de spores dormantes dans du PBS 1X et de spores germées dans de l'eau déionisée ont été remises en suspension dans 1 ml de propan-2-ol et de propan-1-ol respectivement et soumises à un traitement thermique à 85 ° C pendant 15 min. Cela a été suivi d'une centrifugation à 14 000 × g pendant 8 min à l'aide d'une centrifugeuse Beckman Coulter Microfuge 22R. Les culots ont été remis en suspension dans 13 ml et 1 ml de tampon Tris 50 mM pH 7, 4–4% SDS – 30 mM DTT-2 mM EDTA pour les échantillons de spores dormantes et germées, respectivement. Les échantillons ont ensuite été chauffés à 100 °C pendant 16 min puis à 37 °C pendant 40 min.

Pour l'extrait de bactéries végétatives, 3 tubes de culture de C. novyi-NT d'une nuit (5 ml par tube) ont été combinés et remis en suspension dans 1 ml d'eau déminéralisée. L'échantillon a ensuite été chauffé à 85 °C pendant 15 min et centrifugé à 14 000 × g pendant 8 min. Le culot a été remis en suspension dans 10 ml de SDS à 5 % et chauffé à 100 °C pendant 25 min. L'échantillon a été centrifugé à 14 000 × g pendant 8 min et remis en suspension dans 1 ml de SDS à 5 % et de nouveau chauffé à 100 °C pendant 15 min.

Après les traitements thermiques respectifs, les échantillons de spores et de bactéries végétatives ont été centrifugés à 14 000 × g pendant 8 min et les culots ont été lavés cinq fois avec de l'eau déionisée préchauffée à 37 ° C. Le surnageant après la centrifugation finale a été jeté et les culots ont été traités avec 250 µl d'enzyme mutanolysine (125 U/ml dans un tampon phosphate de sodium 12,5 mM pH 5,8) pendant 16 h à 37 °C. Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 14 000 × g pendant 8 min et le surnageant a été lyophilisé pendant une nuit. Les granulés lyophilisés ont ensuite été soumis à une hydrolyse dans HCl 6N 1: 1: acide trifluoroacétique (v / v) dans un tube d'hydrolyse sous vide Thermofisher (Cat n ​​° 29570) et chauffés à 160 ° C pendant 1 h dans un bain d'huile. L'acide a été évaporé en utilisant un concentrateur Eppendorf pendant une nuit et les culots ont été remis en suspension dans 200 ul dans de l'eau désionisée et envoyés pour une analyse supplémentaire.

Pour l'analyse de l'acide aminobutyrique, C. novyi-NT a été cultivé pendant une nuit dans une chambre anaérobie Plas labs dans 5 ml de milieu BHI-10% FBS. 100 microlitres de la culture d'une nuit ont été étalés sur une plaque de gélose BHI-FBS tandis que les plaques témoins étaient striées avec du milieu BHI-10% FBS. Les colonies ont été récoltées le lendemain en utilisant du PBS 1X (500 µl). Les solutions ont été centrifugées à 5000 rcf, 5 min, 4 °C en utilisant une centrifugeuse Beckman Coulter Microfuge 22R. Le culot a été remis en suspension dans 50 % d'acétonitrile et homogénéisé à l'aide du batteur à billes Biospec Mini 24 (3500 rotations/min, 1 min, 4 fois). Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 16 000 rcf pendant 10 min à 4 °C. Les surnageants ont été lyophilisés et remis en suspension dans de l'acétonitrile à 10 % et envoyés pour une analyse plus approfondie.

Pour les analyses de norvaline et de valine, C. novyi-NT a été cultivé pendant une nuit dans une chambre anaérobie Plas labs dans 5 ml de milieu BHI-10% FBS. Les cultures ont été centrifugées à 4700 rcf, 5 min, 4 °C à l'aide d'une centrifugeuse Thermo Scientific Sorvall ST 40R, et le surnageant a été recueilli pour une analyse plus approfondie. Le culot a été remis en suspension dans 50 % d'acétonitrile et homogénéisé à l'aide du batteur à billes Biospec Mini 24 (3500 rotations/min, 1 min, 4 fois). Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 16 000 rcf pendant 10 min à 4 °C. Les échantillons de contrôle du surnageant, du culot et du milieu seul ont été lyophilisés et remis en suspension dans de l'acétonitrile à 10 % (pastille) ou de l'eau (surnageant et milieu de contrôle) et envoyés pour une analyse plus approfondie.

Les spores de C. novyi-NT ont germé dans 91,5 mM (concentration finale avec les spores) de L-cystéine, L-alanine, L-valine, D-valine et de l'eau contenant l'enzyme oxyrase (1:50 v/v) pendant 30 min à 37 °C. Après 30 min, les spores germées ont été culottées à 3900 rcf, 5 min et le surnageant de chaque échantillon a été envoyé pour une analyse plus approfondie.

Tous les extraits de peptidoglycanes, les extraits de métabolites et les échantillons de surnageant ont été analysés à l'aide d'un appareil Agilent 6546 LC/Q-TOF sur une colonne Phenomenex, Synergi 4 µm Fusion-RP 80 A° à l'aide d'un mobile d'acétonitrile et de formiate d'ammonium 10 mM/0,1 % d'acide formique. gradient de phase. Les échantillons ont été dérivés en utilisant de l'o-phtaldialdéhyde et de la N-acétylcystéine dans un tampon méthanol (10%)-tétraborate de sodium. Les spectres LC-MS EIC ont été analysés à l'aide du logiciel MassHunter (Agilent, B.08.00) et de Microsoft Excel.

Les expériences du DOE ont été répliquées deux fois avec deux répétitions techniques intégrées. Des essais de germination des spores à un seul facteur ont été effectués avec 4 répétitions biologiques, à l'exception de la Fig. 1c, où une répétition biologique pour la L-asparagine a été exclue car il s'agissait d'une valeur aberrante claire. Les critères de détection des valeurs aberrantes ont été préétablis comme suit : [xi − médiane(xi)]/(médiane de tous les écarts absolus par rapport à la médiane) à un seuil de 2,5. L'inclusion de la valeur aberrante ne change pas le résultat de l'expérience. Plus de 3,2 × 108 UFC/ml de spores ont été utilisées pour chaque expérience de germination, tandis que des spores de l'ordre de 109 UFC/ml ont été utilisées pour les expériences LC-MS. C'est bien au-delà d'un montant qui pourrait entraîner des erreurs en raison d'un sous-échantillonnage. Les analyses statistiques pour les expériences combinatoires (ANOVA) ont été effectuées à l'aide du logiciel Minitab 20, tandis que les mêmes pour les expériences à facteur unique (test t de Student non apparié) ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism v8.4.3 avec les valeurs p exactes fournies dans le tableau supplémentaire 5. Les moyennes avec écarts-types ont également été calculées à l'aide de GraphPad Prism v8.4.3. Les spectres LC-MS représentatifs ont été déterminés sur la base d'au moins deux échantillons indépendants pour chaque condition. Des images représentatives ont été obtenues sur la base d'au moins deux échantillons indépendants.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données générées ou analysées au cours de cette étude sont incluses dans cet article publié (et ses fichiers d'informations supplémentaires). Les données sources pour les chiffres se trouvent dans les données supplémentaires.

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Nous tenons à remercier le Dr Steven Yuan du laboratoire CMMAC, Université nationale de Singapour pour l'analyse LC-MS. Ce travail a été soutenu par Temasek Life Sciences Laboratory Core Funding (http://www.tll.org.sg) (à IC). Le bailleur de fonds n'a joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Mai Le Ngoc, Marvell Ung Wew, Varsha Ramkumar.

Laboratoire des sciences de la vie Temasek, Singapour, Singapour

Ajitha Sundaresan, Prahlad Raninga, Rongji Sum et Ian Cheong

Département des sciences biologiques, Université nationale de Singapour, Singapour, Singapour

Ajitha Sundaresan, Rongji Sum et Ian Cheong

NUS High School of Mathematics and Sciences, Singapour, Singapour

Mai Le Ngoc, Marvell Ung Wew & Varsha Ramkumar

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Conceptualisation (AS et IC). Conservation des données (AS, LNM, MWU, VR et IC). Analyse formelle (AS, LNM, MWU, VR et IC). Acquisition de financement (IC). Enquête (AS, LNM, MWU, VR, PR et RS). Méthodologie (AS et IC). Gestion de projet (AS). Logiciel (CI). Supervision (AS et IC). Validation (AS). Visualisation (AS et IC). Rédaction – projet original (AS et IC). Rédaction - révision et édition (AS, LNM, MWU, VR, PR, RS et IC).

Correspondance avec Ian Cheong.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Yuting Ma et Gene Chong.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Sundaresan, A., Le Ngoc, M., Wew, MU et al. Un écran de conception d'expériences révèle que la détection de la germination des spores de Clostridium novyi-NT est stéréoflexible pour la valine et ses analogues. Commun Biol 6, 118 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04496-9

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Reçu : 07 juin 2022

Accepté : 17 janvier 2023

Publié: 28 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04496-9

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